АВТОРЫ

НАУЧНЫЕ РАБОТЫ/

Конструирование инфекционной копии генома вакцинного штамма вируса классической чумы свиней

Институт Вирусологии им. Д.И.Ивановского, НПО НАРВАК, Россия; D. Rock, Ph.D.; G. Risatti, Ph.D.: Plum Island Animal Disease Center, США.

Резюме
С целью введения антигенных маркеров в геном вакцинного штамма КС вируса КЧС была сконструирована ДНК- копия его генома и клонирована в E.coli. На ее основе получен инфекционный РНК-геном вируса и впоследствии инфекционный вирус. Данная технология (обратная генетика) позволяет вносить изменения в вирусный геном на стадии ДНК. Она будет также использована для изучения фундаментальных генетических характеристик пестивирусов.


Summary
In order to insert antigenic markers into the genome of vaccine strain CS of CSFV, a DNA-copy of viral genome has been constructed. Based on this copy, an infectious RNA genome and subsequently, infectious virus have been obtained. This technology (reverse genetics) allows now to insert changes in the viral genome at the stage of DNA-copy. It will be used also to study fundamental genetic characteristics of pestiviruses.

Введение
Классическая чума свиней (КЧС) представляет собой весьма серьёзную экономическую проблему, т.к. это инфекционное заболевание, способное вызвать гибель большого числа животных на крупных свиноводческих комплексах. В 1997 г. вспышка КЧС в Европе привела к потере 12 млн. голов, из которых 9 млн. были здоровыми, но были уничтожены согласно существующим правилам Евросоюза, запрещающим вакцинацию и предписывающим плановый убой свиней в зоне риска.
Вирус классической чумы свиней, вирус диареи крупного рогатого скота и вирус пограничной болезни овец относятся к роду Pestivirus, который принадлежит к семейству Flaviviridae (1). Геном пестивирусов представляет собой одну цепь РНК положительной полярности размером около 12,3 тыс. нукл. На 3’-конце пестивирусных геномов не обнаружено полиаденилирования.
В России и ряде других стран проводится поголовная вакцинация свиней против КЧС живыми вакцинами. Практика вакцинации позволяет существенно снизить потери от КЧС. Тем не менее, на фоне вакцинации трудно обнаружить и удалить носителей вирулентных штаммов вируса КЧС серологическими методами.
Применение маркированной вакцины дает шанс на выявление потенциальных вирусоносителей по спектру вирус-специфических антител. Для проверки этой гипотезы необходимо получить вакцинный штамм вируса КЧС, имеющий характерные антигенные маркеры, а также разработать серологический тест для отличия вакцинированных животных, от животных, инфицированных вирулентными штаммами вируса КЧС.
Целенаправленное внесение изменений в РНК-геном вируса КЧС возможно методами обратной генетики, т.е. через получение ДНК-копии генома. В настоящей работе описана сборка и клонирование в E.coli полноразмерной копии генома вакцинного штамма КС. Данный вакцинный штамм ранее был охарактеризован нами на молекулярном уровне (2-5), его геном полностью секвенирован (первичная структура доступна в международном генном банке под кодом AF132116). На основе полученной генноинженерной конструкции был синтезирован РНК-геном штамма КС и получен инфекционный вирус, полностью соответствующий родительскому штамму КС. Таким образом, создан инструмент для внесения генетических изменений в вирус КЧС. Эта технология будет прежде всего использована для внесения антигеных маркеров в вакцинный штамм, а также для изучения фундаментальных генетических характеристик пестивирусов.

Материалы и методы.

Клеточная культура и вирус.
Вирусный штамм "КС" был получен от проф. В. А. Сергеева (4).
Вирус выращивали в культуре клеток РК-15 в среде МЕМ (Gibco BRL), содержащей 5% эмбриональной сыворотки, при 370С в течение 48 часов.
Выделение вирусной РНК. РНК выделяли с использованием Тризола (Gibco BRL) по методике производителя из монослоя зараженных вирусом клеток.
Синтез кДНК и её амплификация. Фрагменты генома получены методом обратной транскрипции и последующей амплификации кДНК методом ПЦР. Для амплификации использовались следующие олигонуклеотиды:
R3126: TCT GTA ACC TGT CTC ATT; F2008: GAT TCT CCA TGA GAT GGG;
R8127: GTG TTC TCT TCT GCT CAC; F8017: AAG CGA TGG TTT GCT AGG
Параметры полимеразной цепной реакции: 94оС - 1 мин ( для первого цикла - 2 мин), 53оС - 45 сек, 72оС – 10 мин. Проводили 25 циклов ПЦР.
Определение первичной последовательности ДНК: Фрагменты ДНК очищали препаративным электрофорезом в геле из легкоплавкой агарозы набором “Clean-up” (Promega). Секвенирование проводили с использованием набора ABI PRISMtm (Perkin Elmer, США) и последующим анализом на автоматическом секвенаторе ABI 377, (США). Олигонуклеотидные праймеры для секвенирования располагались на расстоянии 200 нуклеотидов по каждой цепи, так что расстояние между соседними праймерами на противоположных цепях было 100 нуклеотидов.
Компьютерный анализ: Анализ первичных последовательностей проводили с помощью компьютерных программ: MacVector (Kodak, New Haven, CT), AZ версия 1.0 .
Трансфекция клеток. Геномную РНК вируса КЧС получали in vitro при помощи полимеразы Т7 в условиях, рекомендованных производителем (Promega). Введение РНК в клетки проводили при помощи липофектина (Gibco BRL) по методике производителя.

Результаты исследований

Воссоздание концевых последовательностей генома.
Для клонирования копии генома вируса КЧС под контролем промотора фага Т7 и для обеспечения синтеза полноценного РНК-генома in vitro, были разработаны последовательности концевых фрагментов ДНК. Ниже приведено начало (5’-концевая часть) генома:

5’- TGACGTCGACAGATC TTAATACGACTCACTATA GTATACGAGGTTAGTT...

Одиночным подчеркиванием выделен сайт рестриктазы SalI . Двойным подчеркиванием выделена последовательность промотора фага Т7. Сразу после промотора начинается транскрипционная область. На следующей схеме приведен конец генома (3’-концевая его часть):

...AATTTCCT AACGGCCC*GGGCTCGAGCATT-3’

Одиночным подчеркиванием выделен рестриктазы XhoI . Звездочкой показано место разрезания ДНК при помощи эндонуклеазы рестрикции SfrI. В этом месте заканчивается транскрипционная область, поэтому применение данного фермента позволяет точно отрезать вирусный геном на его 3’-конце, что исключает необходимость более сложных решений. Таким образом, заложена основа для клонирования (по сайтам SalI- XhoI) генома вируса КЧС в плазмиде E.coli, его точного вырезания на 3’-конце (при помощи SfrI), наконец, синтеза полной копии РНК точно с начала транскрипционной области.

Амплификация генома вируса КЧС.
Геном вируса КЧС имеет 12,3 тыс.оснований. Он был полностью секвенирован, после чего была построена его рестриктная карта и определены единичные сайты узнавания рестриктаз (2, 3, 5). Удобно расположенными оказались сайты BglII и SfiI. Полный геном был амплифицирован в полимеразной цепной реакции в виде 3 перекрывающихся фрагментов, как показано на рисунке ниже. Для амплификации использовались олигонуклеотидные праймеры, приведенные в разделе «материалы и методы», а также концевые олигонуклеотиды, содержащие сайты SalI и XhoI.

Сборка вирусного генома и получение инфекционного вируса.
Для сборки генома был использован хорошо известный плазмидный вектор pACYC177, из которого был удален фрагмент, ограниченный сайтами AvaI, XhoI. Были синтезированы комплементарные олигонуклеотиды, образовавшие после отжига полилинкер, содержащий следующие сайты: AvaI-SalI-BglII-SfiI-SfrI-XhoI. После встраивания данного фрагмента в плазмиду был получен вектор, содержащий менее 2 тыс. нуклеотидных пар, пригодный для сборки вирусного генома. Три описанных выше фрагмента генома были встроены в вектор по отдельности, полученные клоны секвенированы. Отобранные клоны, не содержащие мутаций, были использованы для сборки полного генома. Плазмида, содержащая полный геном, была линеаризована при помощи SfrI и использована для синтеза РНК-копии генома при помощи полимеразы фага Т7. Инфекционность рекомбинантной РНК была доказана в опытах по трансфекции клеток. Полученный рекомбинантный вирус не отличался по ростовым характеристикам от своего прототипа. Таким образом, создана конструкция кДНК, позволяющая вносить генетические изменения в вирус КЧС. В дальнейшем планируется введение антигенных маркеров в рекомбинантный вирус, а также будут проведены опыты по изучению генетических детерминант вирулентности пестивирусов.

Список литературы

1. Franki R.I. B., Faquet C.M., Knudson D.L., Brown F. (editors), 1991. Fifth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Archive of Virology. Supplementum 2, 223-233.
2. Непоклонов Е.А. Классическая чума свиней: разработка современных методов диагностики и профилактики. Автореферат на соисканий ученой степени доктора биологических наук. Москва, 2000.
3. Grebennikova, T.V., Zaberezhny, A.D., Paton, D.J., Aliper, T.I., Nepoklonov, E.A. Complete Nucleotide Sequence Of The Vaccine Strain “Cs” Of Classical Swine Fever Virus. Submitted To Deutsche Tierarztliche Wochenschrift
4. Sergeev, V.A., Gruzdev, K.N., Nepoklonov, E.A., Aliper, T.I. // New efficacious live vaccine against classical swine fever and its application strategy to fight the disease without depopulation of swine. Abstracts of O.I.E. Symposium on Classical Swine Fever (Hog Cholera), Birmingham, 9-10 July (1998).
5. Zaberezhny AD, Grebennikova TV, Kurinnov VV, Tsybanov SG, Vishnyakov IF, Biketov SF, Aliper TI, Nepoklonov EA Differentiation between vaccine strain and field isolates of classical swine fever virus using polymerase chain reaction and restriction test. Deutsche Tierarztliche Wochenschrift 1999 Sep;106(9):394-397

на главную Вопросы и ответы

о нас
новости
продукция компании
болезни животных
научные работы
контакты
периодические
ветеринарные
издания


Vetdoctor.ru (ВСЯ ВЕТЕРИНАРИЯ)
  Сайт ведущего
производителя ветеринарных
препаратов
Разработка и дизайн
НПО Нарвак