|
Получение рекомбинантного гликопротеина gp70 вируса кошачьего лейкоза (FeLV )
 Получение рекомбинантного гликопротеина gp70 вируса лейкоза кошек с использованием бакуловирусной системы экспрессии.
Вирус лейкемии кошек (feline leukaemia virus (FeLV) это ретровирус млекопитающих, который вызывает опасное заболевание, широко распространенное во всем мире – лейкемию кошек. Исследования, проведенные в ряде районов Российской Федерации, свидетельствуют о том, что количество кошек, инфицированных вирусом лейкемии, сравнимо со среднестатистическими данными по Европе и колеблется в группах “риска” (бродячие животные, кошки из приютов и питомников) от 12 до 23% Так в Германии количество инфицированных животных составляет 13,4% (Fuchs A. Z. et all. 1994), в Италии – 18 % (Bandecchi P. Q. Et all 1992), в Испании до 30,4% (Aijona A. et.all 2000). Известно, что вакцинация животных против FeLV является основным средством профилактики лейкемии кошек.
В России в настоящее время отсутствуют отечественные вакцины против этой инфекции. В данной работе представлены данные по получению гликопротеина gp70 вируса лейкоза кошек, как компонент для будущей рекомбинантной вакцины.
Для работы были взяты сыворотки крови от кошек с диагнозом лейкемия, подтвержденным исследованиями методом иммуноферментного анализа. (FeLV-testKit, ELV, Нидерланды). Для определения FeLV в сыворотке крови были подобраны диагностические праймеры для “гнездовой” ПЦР. После проведения диагностического теста, получали фрагмент длиной 365 п.н. на участок генома вируса FeLV 6087-7322 п.н. Из сывороток, с наибольшим содержанием РНК FeLV, амплифицировали полную последовательность гена gp70.
Для подбора праймеров использовали первичную последовательность гена gp70 штамма “Rickard” (NCBI, Genebank, AF0527239). Ген был последовательно клонирован в плазмидный вектор pGEM-T Easy и донорный вектор pFastbacHTa бакуловирусной системы экспрессии Bac-to-Bac (Life Technology, США). Полученная рекомбинантная плазмида была использована для получения рекомбинантной бакмиды. После трансфекции рекомбинантной бакмидой клеток насекомых Sf-21 получили экспрессию рекомбинантного белка gp70, несущего на N-конце 6 аминокислотных остатков гистидина. Такая конструкция позволяет очистить рекомбинантный белок на Ni-колонке. Очищенный рекомбинантный гликопротеин был проверен иммуноферментным анализом с использованием моноклональных антител “3-17” полученных к gp70 (ELV, Нидерланды). Полученный рекомбинантный белок будет использован как часть рекомбинантной вакцины против FeLV.
|
|
