НАУЧНЫЕ РАБОТЫ/

Лактоферрин как модулятор иммунного и воспалительного процессов.

D. Legrand, E. Elass, M. Carpentier and J. Mazurier

Тезисы. Лактоферрин – железосвязывающий гликопротеин семейства трансферринов. Высокая экспрессия и секреция лактоферрина в молоко и, особенно, в слизистую пищеварительного тракта определяется тем, что этот белок отвечает за первичную защиту организма. Лактоферрин также является компонентом вторичных гранул нейтрофилов и секретируется непосредственно в очаг инфекции при развитии воспалительного процесса. Дополнительно к антибактериальным свойствам лактоферрина установлена способность этого белка регулировать иммунный ответ организма и защищать его от процессов сепсиса, что было показано в многочисленных исследованиях in vitro и in vivo. Клеточные и молекулярные механизмы действия лактоферрина при модуляции воспаления активно изучаются, а некоторые уже полностью расшифрованы. На клеточном уровне лактоферрин активно влияет на миграцию, созревание, и функциональную активность иммунных клеток, тогда, как на молекулярном уровне лактоферрин, помимо связывания с железом, взаимодействует с различными регуляторными факторами (как растворимыми, так и мембранными), и изменяет их активность. Настоящая статья посвящена обзору нашего современного понимания механизмов защитного действия лактоферрина на различных уровнях.

Введение.

После открытия белка лактоферрина (ЛФ) в молоке, он был назван лактотрансферрин, что подчеркивало его предполагаемую функциональную близость к трансферрину (1). Установление высокой гомологии ЛФ с молекулой сывороточного трансферрина (ТФ) подтверждало то, что ЛФ является железосвязывающим белком. Открытие других свойств ЛФ произошло после того, как были открыты способности этого белка, помимо возможности образовывать комплекс с металлом, связываться с микроорганизмами, клетками организма, и факторами иммунной системы организма млекопитающих. Помимо прямого защитного эффекта ЛФ против бактерий, вирусов, и эукариотических патогенов, ряд экспериментов указывал на то, что этот белок является также модулятором иммунных процессов. Эти свойства ЛФ в настоящее время получили многочисленные подтверждения в исследованиях in vitro и in vivo на животных и человеке, причем результаты некоторых опытов носит противоречивый характер. При изучении модуляционных процессов получение неоднозначных результатов вполне допустимо, потому что, положительный, негативный, или нейтральный эффекты модулирующего агента находятся в прямой зависимости от текущего статуса организма, его состояния. Более того, в регуляционные процессы иммунитета вовлечено очень много факторов, что затрудняет проведение четкой дифференциации действия только молекулы ЛФ на исследуемый организм. Тем не менее, к настоящему времени нами получено большинство ответов на природу молекулярного механизма влияния ЛФ на развитие воспалительного процесса и иммунную реакцию организма. В этой статье мы попытаемся детально рассмотреть и описать наши современные знания, касающиеся этих свойств ЛФ.

Относительное распределение ЛФ в организме.

Синтез и секреция ЛФ может осуществляться конституционно (например, синтез ЛФ секреторными железами), или под гормональным контролем, как в половых органах (2). Альтернативный синтез ЛФ происходит в клетках нейтрофилов на ранней стадии их дифференциации с последующим накоплением этого белка в цитозольных гранулах с возможным его секретирования под действием внешнего сигнала (3). По всей видимости, тип секреции ЛФ зависит от того, какую активность этот белок должен проявить. Так, ЛФ все время присутствует на поверхности слизистого эпителия, проявляя антимикробную активность, тогда, как его секреция в кровь или ткани происходят в ответ на воспаление. Этот белок синтезируется в апоформе (без железа) и присутствует в большинстве биологических жидкостей, например, в слюне, панкреатическом и желудочном соке, слезной жидкости, и, особенно, в молоке (1). ЛФ синтезируется эпителиальными клетками молочной железы, и его концентрация в молоке человека составляет от 1 г/л (в зрелом молоке) до 7 г/л (в молозиве) (4).

Помимо этого, ЛФ синтезируется в миелоцитах на их ранней стадии созревания и, в дальнейшем, входит в состав вторичных гранул нейтрофилов (3). В процессе воспаления, или в результате другой патологии, уровень ЛФ в биологических жидкостей значительно возрастает и может использоваться как биохимический маркер воспаления. Особенно это заметно для плазмы крови, где при нормальных условиях концентрация ЛФ составляет 0.4-2 мг/л, а при воспалении и остром сепсисе может возрастать до 200 мг/л (5,6).

В кровь ЛФ попадает при дегранулировании клеток нейтрофилов и затем быстро связывается и поглощается паренхимными клетками печени (7). Фактически, ЛФ, который определяется в плазме крови, не является абсолютным показателем концентрации этого белка, так как (а) нейтрофилы доставляют ЛФ перед дегрануляцией непосредственно к месту воспаления, и (б) ЛФ может связываться с мембранными глюкозаминогликанами или протеогликанами (8-10), так, что клетки могут создавать очень высокую локальную концентрацию этого белка на своей поверхности. Интересно, что именно иммобилизованный клетками ЛФ, а не свободный белок активирует эозинофилы в дыхательном эпителии (11).

Обзор ключевых функций ЛФ в системе защиты организма.

Защитные функции организма определяются врожденной и приобретенной иммунной системами, которые еще называют гуморальным и клеточным иммунитетом. ЛФ несомненно относится к системе врожденного иммунитета, или неспецифическому иммунитету. Тем не менее, ряд исследований указывают на то, что этот белок, по крайней мере, опосредованно, вовлечен в процессы клеточного иммунитета. Можно сказать, что организм обладает защитными противовоспалительными системами, где ЛФ является одним из ключевых факторов.

Наиболее изученным является механизм антибактериальной активности ЛФ, который секретируется на слизистые поверхности организма и препятствует развитию и колонизации патогенной микрофлоры, или просто лизирует бактерии. Антибактериальные свойства этого белка определяются его высоким сродством к железу и способностью разрушать мембраны микроорганизма при непосредственном контакте (12), тем не менее, эти активности ЛФ не являются предметом обсуждения настоящего обзора. Конститутивный синтез ЛФ и его секреция, а также транспорт этого белка нейтрофилами в очаг воспаления (13) несомненно, усиливают защитный эффект. Помимо своей антибактериальной активности, ЛФ отвечает за активацию или ингибирование функций иммунных клеток, участвующих в развитии процесса воспаления. Биохимически эти регуляторные функции ЛФ определяются его возможностью связывать ионы железа и непосредственно взаимодействовать с рядом биомолекул и мембранами иммунных клеток.

С одной стороны, экспериментальные данные свидетельствуют, что ЛФ действует на пролиферацию, дифференциацию, и активацию клеток, которые прямо или косвенно вовлечены в иммунный ответ организма. С другой стороны, ЛФ снижает противовоспалительные активности защитной системы. В процессе инфицирования ткани генерируется большое количество радикалов, которые разрушают клетки с освобождением железа. Этот окислительный процесс, наряду с экспрессией большого количества, так называемых, провоспалительных факторов, в основном интерлейкина-1 (IL-1) и фактора некроза опухоли альфа (TNF-a), приводит к септическому шоку (14). В этом случае противовоспалительная функция ЛФ проявляется не только в комплексовании с избытком железа, но и в связывании бактериальных провоспалительных агентов, таких как липополисахарид (ЛПС), и их клеточных рецепторов. В процессе связывания железа происходит детоксификация пораженной ткани, а связывание воспалительных индукторов снижает их эффект на активацию иммунных клеток и вовлечение их в дальнейшее развитие воспалительного процесса. Молекулярные и клеточные основы участия ЛФ в иммунных реакциях рассматриваются в следующих разделах этого обзора.

Полноправный представитель семейства трансферрина, но с особенными свойствами.

Лактоферрин относится к семейству белков в котором трансферрин наиболее хорошо охарактеризован. Человеческий лактоферрин (чЛФ) представляет собой полипептид из 692 аминокислотных остатков (15), его трехмерная структура была определена с высоким разрешением (16). Оба белка, чЛФ и трансферрин, имеют чрезвычайно схожую структуру, но первичная гомология составляет только 60%. Различия особенно отмечаются в аминокислотных последовательностях, которые экстраполированы на поверхность белковой глобулы, которые и отвечают за физиологические активности этих биомолекул. Тогда, как изоэлектрическая точка трансферрина соответствует рН 6,5, чЛФ является основным белком с pI 8.5 – 9.0. Наибольший вклад в позитивный заряд этого белка вносит N – концевой участок, так называемый, лактоферрицин (ЛФц) (Рис.1а), который, как установлено, отвечает за многие защитные функции ЛФ (17). ЛФц выделен из нативной молекулы ЛФ после ограниченного протеолиза пепсином (для чЛФ аминокислотные последовательности 1-19 и 20-37, для коровьего ЛФ – 19-36) и содержал основные аминокислоты, образующие бета-слой и а-спиральную структуру, отвечающую за независимые от связывания железа функции ЛФ. Это относится не только к бактерицидной активности, но и к иммуннорегуляторным и противовоспалительным свойствам ЛФ (18). В настоящее время установлен еще один основной пептид в структуре ЛФ (остатки 268-284), который назвали лактоферрампин, показаны его бактерицидные активности против ряда патогенных микроорганизмов (19).

Интересен факт прочного связывания железа лактоферрином даже при рН 3 и ниже, тогда как трансферрин теряет связанный ион металла уже при рН 5.5. Биохимически это определяется присутствием дополнительной водородной связи между 2-мя лизиновыми остатками в трансферрине, что ослабляет его взаимодействие с ионом металла (20,21), тогда, как в молекуле ЛФ две доли белка более плотно прилегают друг к другу (22). Высокая аффинность ЛФ к железу усиливает не только его антибактериальные функции, но и позволяет ему проявлять антиоксидазные свойства, которые подробно будут рассмотрены ниже.

Связывание ЛФ с лигандами и рецепторами.

Катионный характер молекулы ЛФ позволяет ей связываться со многими биомолекулами, которые отрицательно заряжены, что делает затруднительным изучение специфического взаимодействия ЛФ с лигандами, а это важно в проявлении его иммуннорегуляторых свойств. Сульфатированные протеогликаны, присутствующие на поверхности клеток, на 80% определяют сорбцию ЛФ на клетках (10,23). Несмотря на низкую аффинность этого взаимодействия (Ка ~ 106 M) и ионный характер этого взаимодействия, считается общепринятым, что именно взаимодействие с протеогликанами определяет высокую плотность молекул ЛФ на поверхности клетки (несколько миллионов центров связывания для некоторых типов клеток) (23). Взаимодействие ЛФ с глюкозаминогликанами очень важно при регуляции воспаления. Основные функциональные домены молекулы ЛФ, определяющие взаимодействие этого белка с глюкозаминогликанами и свободным гепарином, были определены как аминокислотные последовательности 1GRRRRS6 и 28RKVR31 (9, 10, 23). Эти участки молекулы ЛФ образуют катионное «седло» (Рис1Б), которое связывает сульфатированную цепь лиганда (9).

Помимо протеогликанов, было открыто несколько клеточных рецепторов, которые модулируют сигнальные пути, определяют эндоцитоз, и проникновение ЛФ в ядро. Например, 105 kDa специфический рецептор, который идентифицирован на поверхности лимфоцитов, тромбоцитов, и клеток молочной железы, обеспечивает эндоцитоз ЛФ этими клетками (25-27). Относительно недавно было показано специфическое взаимодействие ЛФ с рецептором нуклеолин, который экспрессируется на поверхность делящихся клеток и так же, как и протеогликаны, отвечает за эндоцитоз и транспорт ЛФ в ядро (28). Еще до получения прямого экспериментального подтверждения такого взаимодействия, было много данных, указывающих на то, что нуклеолин является рецептором ЛФ, причем домены связывания этого белка в молекуле ЛФ отличаются от известных центров связывания.

Другой важный рецептор ЛФ – рецептор-подобный липопротеин, который не только обеспечивает эндоцитоз ЛФ, но и участвует в пролиферации остеобластов после контакта с ЛФ (29). Этот же рецептор найден на поверхности иммунных клеток, что указывает на его возможную роль в иммунномодуляционных процессах. И, наконец, показано, что белок 34 kDa, который локализован на мембранах клеток тонкого кишечника, отвечает за интернализацию ЛФ в клеточный цитозоль (30,31).

Отдельно рассматриваются растворимые отрицательно заряженные биомолекулы, которые связываются с ЛФ, что наиболее важно при проявлении этим белком противовоспалительных свойств. Прежде всего, это липополисахарид (ЛПС) Escherichia coli, который взаимодействует с ЛФ через свой липид А (32,33). В молекуле чЛФ было обнаружено 2 центра связывания ЛПС E. coli, которые локализованы в разных долях белка и имеют различные константы диссоциации (Кi 3.6нМ и 390нМ для N- и С-доли соответственно) (34).

Установлено, что обе последовательности 1GRRRR5 и 28RKVRGPP34, которые отвечают за взаимодействие с 105-kDa ЛФ рецептором, глюкозаминогликанами, и ДНК (9,10,24), участвуют вместе или раздельно в связывании с молекулами ЛПС с высокой аффинностью (34, 35). Показано, что такие провоспалительные факторы, как олигонуклеотиды с неметелированными CpG также нейтрализуются белком ЛФ (36). Наиболее важным считается взаимодействие с высокой биоспецифичностью (Kd ~ 16 нМ) между ЛФ и растворимым фактором CD14, который является рецептором для ЛПС (sCD14). Установлено, что ЛФ связывает не только свободный фактор sCD14, но и, через специальный механизм, комплексы sCD14 с ЛПС, или ЛипидА-олигосахарид (37).

Положительно заряженные домены ЛФ важны при взаимодействии с ЛПС, рецепторами, и воспалительными факторами (37). Более того, сам лактоферрицин, как отдельный пептид, взаимодействует с ЛПС (18,34,38,39), но отмечается, что это взаимодействие происходит не с липидом А эндотоксина, а другими отрицательно заряженными участками ЛПС молекулы (40).

Рисунок 1. Центры связывания чЛФ.

Является ли ЛФ сигнальной молекулой для клеток?

Связывание ЛФ с поверхностью клеток позволяет предположить, что этот белок может активировать таким образом дифференциацию и/или пролиферацию клеток. Ряд данных, изложенных ниже, подтверждают это предположение, однако еще не изучен биохимический механизм, как именно ЛФ активирует клетку. В связи с этим интересно недавнее открытие, где показано, что клеточный рецептор на поверхности остеобластов проявляет митогенную активность после связывания с ЛФ через р42/44 МАР-киназный метаболический сигнал (29). Такой же сигнальный путь был показан для лимфобластоцитов Т, которые содержат 105-kDa ЛФ рецептор (41). Высказывается предположение, что ЛФ может проникать в клеточное ядро и действовать, как активатор транскрипции (42). Это подтверждается последними исследованиями, которые указывают на то, что рецептор нуклеолин является возможным переносчиком ЛФ с поверхности клетки в ядро (28).

Было установлено, что ЛФ снижает экспрессию ЛПС-индуцируемых цитокинов в Т1-хелперах после интернализации в иммунную клетку и ингибирования действия ядерного транскрипционного фактора NF-kB (43). Механизм этого действия еще полностью не открыт, но известно, что именно фактор NF-kB играет критическую роль в процессе развития воспаления и иммунного ответа организма. Исследования Oh с соавторами (44) показывает сложную последовательность сигнальных реакций, в которых участвует ЛФ. Высокая концентрация этого белка работает как р53 трансактиватор генов, стимулируя действие ингибитора киназной активности белка, который, в свою очередь, регулирует фактор NF-kB и его связывание с ДНК. Эти же авторы предварительно установили трансактивацию гена матричной металлопротеиназы 1 через активацию лактоферрином МАР-киназного сигнала, отвечающего за реакцию организма на стресс (42).

In vivo доказательства регуляторных функций ЛФ.

Получение прямых экспериментальных доказательств регуляции иммунной системы белком ЛФ крайне затруднительно, хотя в настоящее время для этих целей в опытах используют лабораторных животных с дефицитом по гену ЛФ (45). Впервые предположение участия этого белка в модуляции иммунного ответа было высказано в 1980г. (46) при наблюдении за пациентом с молекулярной мутацией, у которого белок ЛФ отсутствовал в нейтрофилах, но синтезировался внутренними железами (47) – этот больной страдал хроническими инфекционными воспалениями.

В настоящее время, в экспериментах с трансгенными мышами, несущих ген чЛФ, установлено, что эти животные более устойчивы к инфекционным заболеваниям (48). Такой же эффект наблюдался при прямом ингибировании ЛФ-ном роста Staphylococcus aureus и усилении активности Т-хелперных клеток 1 типа при экспрессии и накоплении ЛФ в животных тканях. Более того, заражаемость туберкулезом мышей, несущих дефект по белку 2b-микроглобулин, значительно снижалась после введения ЛФ (49). Пероральное применение ЛФ также защищает организм от ряда бактериальных инфекций (50), от летальной бактериемии животных (51,52) и при острых оральных кандидозах (53). Например, оральное введение ЛФ полностью защищает поросят от сепсиса, вызываемого энтеротоксинами (54).

Экспериментально установлено, что на молекулярном уровне экзогенный ЛФ подавляет экспрессию определенных цитокинов, в основном, провоспалительных (интерферон-g, интерлейкин-1b, -6, -5, -10, TNF-alpha, и стимулирующего фактора гранулоцитов-макрофагов GM-CSF (48,55-58). ЛФ-зависимая активация экспрессии наблюдается для таких антивоспалительных факторов, как IL-4 и IL-10 при пероральном введении этого белка лабораторным крысам с острыми колитами (59). На клеточном уровне наблюдается увеличение титра нормальных клеток - киллеров (NK) (60,61), усиливается фагоцитарный эффект (18,62), активируются нейтрофилы (63), и модулируется процесс миелопоэза (56).

Эффект ЛФ на гуморальный и клеточный иммунный ответ организма.

В in vitro экспериментах было показано, что ЛФ может ускорять созревание клеток, выполняя функцию альтернативного источника железа для Т-клеток (25,64), но последние исследования in vivo установили, что ЛФ, в основном, работает как фактор связывания железа и защищает организм от избытка этого металла (48,49). Практически, все механизмы активации лактоферрином иммунной системы включают этап непосредственного контакта этой биомолекулы с мембранами клеткок. Это предполагает наличие специфических рецепторов ЛФ, которые являются ключевыми эффекторами клеточного сигнала, эндоцитоза и/или транспорта ЛФ в ядро клетки (65). К сожалению, некоторые результаты изучения этих эффекторов противоречат друг другу.

Установлено, что ЛФ регулирует созревание и активацию лимфоцитов, проявляет дифференцирующий эффект на изолированные тимоциты и В-клетки (66,67), а также, связываясь с Т-клетками, усиливает экспрессию CD4 антигена (41). Более того, у больных с раком мочеполовых путей показано, что ЛФ регулирует экспрессию x цепи рецептора Т-клеток (68). Усиление клеточной литической активности – еще одна важная функция этого белка. ЛФ, экспрессируясь на поверхность зрелых нейтрофилов, может участвовать в связывании микроорганизмов (69). Массовое освобождение ЛФ из гранул происходит после индукции нейтрофилов TNF-a фактором (70,71), часть белка связывается с поверхностью нейтрофилов, но, как показано, и связанный, и свободный ЛФ, усиливает фагоцитарную активность нейтрофилов и моноцитов/макрофагов.

ЛФ является промотором подвижности клеток, образования супероксида, и продукции таких провоспалительных молекул, как NO, TNF-a и IL-8 (72–74) В последних исследованиях установлено, что ЛФ усиливает фагоцитарную клеточную активность против возбудителя S. aureus (75). Молекулярный механизм этих свойств лактоферрина по разным данным крайне неоднозначный. Известно, что фагоцитарная активность нейтрофилов регулируется производными комплимента, в частности, комплиментарным фактором С3. Тогда не понятно, как ЛФ активирует нейтрофилы, потому что он ингибирует классическую (76) и одновременно активирует альтернативную (75,77) реакции комплимента. Последние работы показывают, что пептид лактоферрицин подавляет классическую реакцию комплимента, но не альтернативную реакцию (78), и что при связывании ЛФ с нейтрофилами также демонстрируется эта ингибирующая активность (79).

Ряд современных исследований указывают на иммуннотропную активность молекулы ЛФ, когда этот белок проявляет «эффект усилителя» при генерации гиперчувствительности организма (80), и пролиферирует действие вакцины БЦЖ на накопление Т-хелперных клеток в мышах (81). Этот эффект можно объяснить взаимодействием ЛФ с маннозным рецептором незрелых антиген-узнающих эпителиальных клеток (80). Именно такое взаимодействие показано в эксперименте, где ЛФ, связываясь с дендритными клетками через поверхностный белок DC-SIGN, блокирует взаимодействие этих клеток с ВИЧ гликопротеином gp120 и последующую вирусную трансмиссию (82).

Антивоспалительные свойства.

В последние годы появилось много публикаций по изучению противовоспалительныч свойств ЛФ. Модуляция воспалительного процесса ЛФ-ном, в основном, осуществляется через ингибирование синтеза цитокинов, которые активируют иммунные клетки в очаге воспаления. Человеческий ЛФ супрессирует TNF-а, IL-1, и IL-6 синтез в мононуклеарных клетках in vitro and in vivo, реагирующих на присутствие энтеротоксина (43, 58, 83–85). ЛФ регулирует продуцирование цитокинов спленоцитами (86), и, дополнительно, ЛФ усиливает секрецию IL-10 и IL-4 (59). Подавление экспрессии провоспалительных регуляторных молекул может определяться ЛПС-связывающей активностью ЛФ через участок лактоферрицина (32-34), показано, что ЛФц самостоятельно, нейтрализует ЛПС активность (85,87). В этом процессе ЛФ является конкурентом специального ЛПС-связывающего белка крови, который переносит энтеротоксин на мембранный фактор mCD14, локализованный на клетках макрофагов (35).

ЛФ также ингибирует образование перекиси водорода, являясь промежуточным звеном при связывании ЛПС с L-селектином нейтрофилов (88). Более этого, взаимодействие между ЛФ и растворимой формой фактора CD14 ингибирует экспрессию IL-8 - хемокина, который активируется комплексом CD14-ЛПС в эндотелии (89).Существуют другие, описанные в литературе, механизмы провоспалительной активности ЛФ, отличные от связывания ЛПС и CD14. Подавление синтеза IL-6, который индуцируется TNF-a (85), является результатом ингибирования транскрипционного фактора NF-kB в моноцитных клетках, который, в свою очередь, связываясь с TNF-промотором, активирует его синтез (43). Другой пример – ингибирование иммуностимулирующего эффекта эндотоксином на В-клетки может зависеть от связывания ЛФ-ном неметелированных олигонуклеотидов (36). В коллаген-индуцированных экспериментальных моделях воспалительного процесса и моделях сепсиса на лабораторных животных, введение ЛФ в кровь приводило к усилению защиты организма и подавлению воспаления (90). Это подтверждалось и в экспериментах, когда пероральное введение ЛФ подавляет экспрессию фактора TNF-a и секрецию IL-10 при артритах (91). Рекомбинантный и молочный белок ЛФ (человека и коровы) также защищает лабораторных животных от энтеротоксин-индуцированного прерывания беременности, ингибируя синтез IL-6 (92). Как отмечалось выше, ЛФ может регулировать процессы воспаления, вызываемые вирусными заболеваниями. Так, Sano с соавторами (93) показали, что ЛФ снижал уровень инфицирования дыхательным синцитиальным вирусом (RSV), взаимодействуя с его поверхностным антигеном (93).

.Провоспалительные свойства ЛФ.

Ряд экспериментальных работ указывает на то, что ЛФ, при определенных условиях, активирует макрофаги и индуцирует уровень IL-8, TNF-a, и нитроксида (NO), являясь, таким образом, провоспалительным фактором (74). Комплекс ЛФ-ЛПС, в этом случае, является индуктором воспалительных медиаторов в макрофагах, действуя через Толл-подобный рецептор 4 (94). Более того, после инкубации с комплексом ЛФ-ЛПС, клетки становятся толерантными к действию энтеротоксина (94). ЛФ восстанавливает гуморальный иммунный ответ и увеличивает продукцию IL-6 альвеолярными и перитональными клетками при иммуннодефицитном состоянии (95,96). В этой же экспериментальной модели показано, что ЛФ повышал титр CD3+ T-клеток, таким образом, восстанавливая передаваемый этими клетками иммунный ответ при воспалении (97). Пероральное введение ЛФ защищает организм от потери веса и усиливает цитокиновый сигнал при инфицировании вирусом герпеса (98). Нативная форма ЛФ, или его пепсиновый гидролизат, индуцирует синтез IL-18 эпителиальными клетками малого кишечника, что вызывает изменение уровня экспрессии ряда генов провоспалительных факторов, включая, интерферон-гамма (IFN-g) (99). Авторы этого исследования приходят к выводу, что такой механизм, по-видимому, является основным при подавлении лактоферрином процессов канцерогенеза и развития метастазов. Помимо этого, индукция синтеза IL-18 в плазме крови приводит к блокированию эндотелиального роста, что может объяснить ингибирование ангиогенеза лактоферрином вокруг опухолевых клеток (100).

Введение препарата ЛФ в течении определенного времени больным с хроническим гепатитом С приводит к смещению провоспалительного процесса в периферийной крови в сторону образования Т1 хелперных цитокинов, которые существенно усиливают действие традиционной интерфероновой терапии гепатитов (101). Усиление экспрессии IFN-g и тканевого некротического фактора альфа (TNF-a) лимфатическими клетками слизистой половых органов под действием ЛФ усиливает термолабильность и гибель Candida albicans (53).

Роль ЛФ в стимулировании и привлечении лейкоцитов в очаги воспаления.

Взаимодействие ЛФ с ЛПС и с растворимой формой фактора CD14 приводит не только к активации иммунных клеток, но и к синтезу специальных адгезирующих молекул на поверхности эндотелиальных клеток, которые мобилизуют и направляют лейкоциты в очаги воспаления. В частности, ЛФ индуцирует экспрессию эндотелиальными клетками человека белка Е-селектина, межклеточного адгезирующего фактора 1 ((ICAM-1) и IL-8 (88,89). Указывается, что ЛФ конкурирует с хемокинами за их связывание с протеогликанами и последующее их взаимодействие с лейкоцитами. Был установлен интересный факт, когда при пероральном введении ЛФ происходит защита кишечника от воспаления при приеме нестероидных лекарств за счет снижения миграции нейтрофилов в поражаемые ткани (102). С другой стороны, показано, что ЛФ мобилизует нейтрофилы к очагу воспаления при повышенной бактериемии (103). Так, Takakura с соавторами (53) установили, что снижение оральных кандидозов под действием ЛФ происходит за счет увеличения числа лейкоцитов и секретируемых ими цитокинов в очаге воспаления.

Роль ЛФ в гомеостазе железа и детоксификации.

ЛФ в настоящее время рассматривается как мощный регулятор общих воспалительных процессов. Связывание этой молекулой свободного железа, который накапливается в пораженных тканях и катализирует образование токсичных гидроксильных радикалов, является одним из основных антивоспалительных свойств ЛФ. Апоформа этого белка (ЛФ без железа) секретируется из гранул нейтрофилов непосредственно в очаг воспаления, прочно связывает даже при низких рН ионы железа, и таким образом проводит детоксификацию пораженной ткани. При нейродегенеративных заболеваниях, где ионы железа приводят к окислительному стрессу и гибели нервных клеток, наблюдается повышенное присутствие ЛФ в определенных областях мозга (104). Этот факт, а также то, что при таких заболеваниях происходит активация трансцитозного переноса ЛФ из крови в нервную ткань с острым воспалением (105), указывают на защитную роль ЛФ от окислительного шока и поражения мозга.

ЛФ и аллергии.

Результаты In vivo показывают, что ЛФ защищает от аллергии кожные покровы и легкие (106,107). Аллергия сопровождается активацией тучных клеток и базофилов, а также миграцией антиген-узнающих клеток которые индуцируются факторами IL-1b и TNF-a (108). Пациенты с аллергиями имеют повышенный уровень белка ЛФ в биологических жидкостях. При кожных аллергиях ЛФ, связываясь с кератоцитами, ингибирует секрецию TNF-a этими клетками (109). Дополнительно, установлено, что ЛФ инактивирует триптазу, провоспалительный протеолитический фермент, который экстрагируется тучными клетками (110). ЛФ вытесняет триптазу из ее комплекса с гепарином и таким образом подавляет ее протеолическую активность. Было показано, что тучные клетки захватывают молекулу ЛФ, которая после этого ингибирует не только триптазу, но и проаллергены химазу и катепсин Г (111). Эти же авторы показали, что ЛФ ингибирует образование гистамина и триптазы в тучных клетках толстого кишечника (112,113).

ЛФ как маркер при воспалительных заболеваниях.

В связи с тем, что уровень ЛФ может драматически возрастать во время сепсиса в биологических жидкостях (5,6), естественно, возникает вопрос о возможности использовать концентрационные параметры этого белка, как биомаркер воспалительных процессов.

Например, во время ревматоидных артритов, уровень ЛФ возрастает в мочеполовых выделениях, но не в крови. ЛФ считается достоверным маркеров активации нейтрофилов при ревматоидах, но не является маркером активности и динамики воспалительного заболевания (114). Повышение концентрации ЛФ во время острого респираторного синдрома (SARS) является, скорее всего, показателем активности системы врожденного иммунитета, а не специфического иммунитета. Показана 148-кратная активация экспрессии гена ЛФ периферийными мононуклеарными клетками во время заболевания SARS (115). Приведенные наблюдения открывают новые возможности при диагностике и лечении этого синдрома.

Достоверная диагностика острого кишечного воспаления у пациентов с диареей и желудочно-кишечной болью возможна по анализу концентрации фекального ЛФ (116, 117). Уровень ЛФ резко возрастает в отобранных образцах, что коррелирует с активацией лейкоцитов в очаге воспаления. Показано, что ЛФ является высокочувствительным и специфическим биомаркером хронического желудочного воспаления (118). Стабильность этого показателя делает количественный анализ ЛФ важным тестом в клинической лаборатории (119).

И, наконец, Buderus с соавторами [120] идентифицировали ЛФ, как маркер кишечного воспаления и терапевтического ответа пациента при болезни Крона. Таким образом, определение уровня ЛФ можно использовать в качестве клинического маркера при различных воспалительных заболеваниях.

Применение ЛФ в профилактике воспалительных заболеваний и инфекциях.

Установлено, ЛФ оказывает влияние на неспецифический иммунный ответ у ряда промысловых рыб (121), в то время как гуморальный иммунный ответ не зависит от введения ЛФ. Этот белок эффективно модулирует врожденную иммунную клеточную активность рыб, в основном, нормальную цитотоксичную активность, и воспалительные процессы в дыхательной системе. В настоящее время ЛФ используется как иммунномодулятор при разведении морских лещей (gilthead seabream) (121).

Показано усиление экспрессии IFN-a и активности нормальных клеток-киллеров у добровольцев при приеме липосомальной формы ЛФ (122). Пероральное введение ЛФ снижает концентрацию эндотоксина в кишечном тракте, и, подобно бифидобактерии, увеличивает титр В и Т клеток и экспрессию цитокинов (IL-6, TNF-a, IFN-g) в межворсинковом пространстве слизистой кишечника (123). Интересно, что ЛФ может переносится из малого кишечника в кровь через мезентеральную лимфатическую систему (124). Тем не менее, пероральное введение ЛФ используется, прежде всего, для регуляции системного иммунного ответа слизистой пищеварительного тракта (125). Добавление ЛФ в питьевую воду не приводит к видимым изменениям в иммунном статусе организма, а постоянное введение этого белка в желудок или использование при длительной диете, приводит к синтезу анти-ЛФ иммуноглобулинов.

Все клинические модели использования ЛФ при пероральном введении показывают усиление системного клеточного ответа через Т2 хелперные клетки с одной стороны, и модуляции иммунной реакции слизистой через увеличении синтеза кишечных иммуноглобулинов А (IgA). Однако, при длительном использовании ЛФ, также активируется гуморальный иммунный ответ с синтезом IgG2а антител в крови и возрастает уровень цитокинов, присущих Т1 хелперные клетки. Это должно учитываться при разработке перорального режима введения ЛФ.

Заключение:

Можно утверждать, что в последние годы произошел важный прорыв в изучении ЛФ, особенно, в открытии механизма инактивации этим белком экзогенных провоспалительных факторов. ЛФ также связывает избыток железа и энтеротоксина, таким образом, модулируя иммунные процессы, которые активируются этими компонентами. Дополнительно, ЛФ взаимодействует с рядом клеточных рецепторов таких, как протеогликаны, аполипопротеин Е/липопротеин низкой плотности (ApoE/LDL) - рецептор, нуклеолин, рецепторы лимфоцитов и энтероцитов. Результатом этого взаимодействия является индукция определенных биологических процессов, изучение которых требует время.

Свойства ЛФ зависят от уровня его экспрессии, секреции, и присутствии в определенном месте организма при его определенном физиологическом состоянии. При нормальных условиях ЛФ синтезируется клетками желез и экспрессируется на поверхность слизистой, создавая мощный бактериостатический и бактерицидный барьер между окружающей средой и организмом. Нейродегенеративные заболевания или воспалительный процесс приводит к дегрануляции нейтрофилов в очаге воспаления, активации специальных нейронов и микроглиадильных клеток, соответственно (104), что драматически увеличивает уровень ЛФ в области воспаления.

Этот белок взаимодействует с рецепторами различных типов клеток с последующим его эндоцитозом. На рисунке 2 изображены процессы, которые модулируются ЛФ. В основном, связывание железа, ЛПС, и CD14, модуляция действия иммунных факторов ЛФ-ном приводит к снижению воспалительного ответа организма, как показано во многих исследованиях .

Дополнительное введение ЛФ в диету дает весьма определенные положительные физиологические эффекты. В этом случае очень важен источник выделения лактоферрина, трансгенный или натуральный белок используется, из какого организма, и т.д. Например, лактоферрин из коровьего молока имеет абсолютно другой тип и процент гликозилирования по сравнению с человеческим белком, что может приводить к проявлению неспецифических активностей и потерей других, ожидаемых свойств лактоферрина. Естественно, что при введении в кровь пациента такой белок воспринимается как чужеродный агент и может вызвать анафилактический шок.

Рисунок 2.

Регуляция воспалительного процесса под действием белка ЛФ. Голубым показаны физиологические процессы, Красным обозначены биологические реакции в ответ на инфекцию или нейродегенеративные процессы, Зеленые стрелы указывают на ингибирование, вызываемое освобождением ЛФ в воспалительный очаг.

Список литературы: