НАУЧНЫЕ РАБОТЫ/

Лактоферрин: важный защитный фактор организма против микроорганизмов и вирусов.

P. Valenti, and G. Antonini

Тезисы. Ранее считалось, что основная функция, которой обладает белок лактоферрин (ЛФ), железосвязывающий фактор врожденной защитной системы организма, является антибактериальная активность, связанная с возможностью этого белка прочно связываться с железом. В настоящее время установлено, что независимо от аффинности ЛФ к железу, этот белок проявляет бактерицидные свойства, которые определяются его прямым взаимодействием с поверхностью микроорганизмов. Более того, много других защитных функций ЛФ против микробов и вирусов было открыто и исследовано в последние годы. Например, при секреции на слизистую, ЛФ модулирует подвижность и колонизацию патогенного микроорганизма. Этот белок ингибирует адгезию бактерии на небиологические поверхности путем ионного взаимодействия с этими поверхностями, и/или непосредственно с клеточной стенкой микроорганизма. Для подавления адгезии микроба на поверхности клеток в организме млекопитающего, ЛФ также должен непосредственно взаимодействовать с мембранами клеток или/и связываться с патогеном. Установлено, что ЛФ подавляет интернализацию микроорганизма клеткой, связываясь с глюкозаминогликанами клетки-мишени и бактериальными белками, которые могут в дальнейшем гидролизоваться лактоферрином. Более того, ЛФ может транспортироваться в ядро клетки и ингибировать проникновение микроорганизма в клетку-мишень через регуляцию экспрессии определенных генов. И, наконец, возможность ЛФ защищать организм от вирусного заболевания в результате связывания с вирусными частицами и/или рецепторами клеток хозяина, позволяет утверждать, что ЛФ является одним из ключевых компонентов первичной защиты млекопитающих против атак микроорганизмов и вирусов.

Введение.

Лактоферрин проявляет много биологических функций, которые относятся к преиммунной защитной системе организма (1,2). Антибактериальная активность для этого белка была установлена первой (3,4), так, было показано, что лактоферрины из нескольких видов млекопитающих подавляли рост ряда бактерий, включая патогенные для человека и животных штаммы Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Shigella dysenteriae, Listeria monocytogenes, Streptococcus spp., Vibrio cholerae, Legionella pneumophila, Klebsiella pneumophila, Enterococcus spp., Staphylococcus spp., Bacillus stearothermophilus и Bacillus subtilis (5–9). Результаты опытов in vitro получили подтверждение в экспериментах с лабораторными животными в классических работах Bullen с соавторами (10) на модели заражения морских свинок патогенным штаммом E. coli 0111. Прямое доказательство антибактериальной активности ЛФ было получено в опытах, когда пероральное введение этого белка приводило к подавлению бактериальной инфекции пищеварительной системы (8,11-13), при этом развитие полезных для организма микроорганизмов Lactobacillus и Bifidobacteria стимулировалось лактоферрином (14). Внутривенное, внутрибрюшинное, или внутримышечное администрирование экзогенного ЛФ приводит к его быстрому удалению из крови через печень (15-17). Бактериостатическая функция ЛФ, которая была изучена первой, определяется его способностью связывать железо из окружающей среды, что угнетает рост микроорганизмов. В дальнейшем было открыто множество противопатогенных активностей ЛФ и большинство из которых определяются прямым действием ЛФ на бактерию, вирус, паразит, или другой болезнетворный агент. В настоящем обзоре мы представим наши современные знания защитных свойств ЛФ и перспективы их практического использования.

Бактериостатическая активность обусловленная связыванием железа.

Все бактерии нуждаются в железе для своего развития, поэтому существует строгая корреляция между доступностью ионов железа и вирулентностью микроорганизма. В слизистой кишечника и легких, где находится первичная линия защиты организма против микрофлоры, низкий уровень железа определяет ингибирование роста патогенов. В случае высокой концентрации железа из-за какой-либо патологии в организме бактериальная вирулентность резко возрастает. Молекула ЛФ секретируется в свободной от железа форме (аполактоферрин) (18), и обладает чрезвычайно высокой аффинностью к 3-х валентному железу. Комплекс ЛФ двумя иона железа намного прочнее, чем комплекс трансферрина (основного переносчика железа в организме) с этим металлом (19,20). Присутствие белка апоЛФ в межклеточном пространстве или слизистой определяет низкий уровень железа, который недостаточен для активного развития патогенной микрофлоры (21), что экспериментально показано для многих видов бактерий (5). Необходимо отметить, что подобная антимикробная активность называется бактериостатической и, в случае появления избытка свободного железа, бактериальный рост восстанавливается. Более того, ряд патогенов могут преодолевать этот защитный барьер и решать проблему дефицита железа двумя путями - синтезируя собственные хелатирующие металл биомолекулы, или отбирая железо непосредственно у трансферрина и/или ЛФ. В первом случае бактерия синтезирует и секретирует небольшие молекулы, которые образуют комплексы с железом (их называют сайдерофоры) и конкурируют с ЛФ за связывание нерастворимых ионов железа. Сайдерофоры можно отнести к вирулентным бактериальным факторам – особо активные патогенные штаммы обладают именно такой системой обеспечения себя железом (22,23). В другом случае, микроорганизм для своего развития забирает железо у гемина (продукт окисления гема), но ЛФ может эффективно конкурировать с бактерией за гемированное железо (24). Ряд Грам-отрицательных патогенов могут получать железо непосредственно от ЛФ или трансферрина (23,25,26). Такой механизм получения железа присутствует у высоко адаптированных бактерий и определяется связыванием белковой молекулы ЛФ или ТФ, содержащей железо, с двумя поверхностными рецепторами микроорганизма (27). Для ЛФ эти рецепторы называют ЛФ-связывающие белки А и Б (LbpA и LbpB) (28,29). Предполагается, что при взаимодействии ЛФ с рецептором LbpA происходят конформационные изменения этого полипептида, что приводит к ослаблению связи белка с железом в С-концевой части белка (30).

Бактерицидная активность ЛФ.

Как показано выше, дефицит железа в среде, который создает ЛФ, только замедляет бактериальный рост, однако в классической работе Arnold с соавторами (31) был открыта бактерицидная активность человеческого ЛФ, которая не зависит от способности этого белка связывать железо (32,33). Биохимические исследования ЛФ животных и его аналога из птиц овотрансферрина продемонстрировали, что бактерия взаимодействует с положительно заряженными участками полипептида ЛФ (34-36), причем, эти же участки белка могут взаимодействовать с клетками хозяина (37). Молекулярный механизм бактерицидной активности ЛФ для Грам- и Грам+ микроорганизмов сходен и в обоих случаях и вызывает разрушение бактериальной мембраны. Для Грам-негативных бактерий установлено, что ЛФ связывается с, так называемыми, поринами, которые находятся на внешней мембране микроорганизмов (38), и индуцирует быстрое освобождение липополисахаридов (ЛПС). Это приводит к повышенной осмочувствительности клетки микроорганизма, еу доступности к лизоциму, и другим антибактериальным факторам, и, как следствие, гибели бактерии (39). ЛФ может освобождать бактериальный ЛПС благодаря своей положительно заряженной N-концевой последовательности (37). Надо отметить, что практически во всех лактоферринах, независимо от источника их выделения, железонезависимая антибактериальная активность определяется положительно заряженными участками, локализованными в N-концевой области белка (40-43). Эти домены взаимодействуют с наружной частью молекулы ЛПС, липидом А (44,45), по очень схожему механизму, который проявляет поликатионный антибактериальный пептид полимиксин Б (46). Показано, что ионы кальция подавляют освобождение ЛПС лактоферрином, что позволяет высказать предположение о связывании ЛФ с этими ионами по механизму хелатирующего агента ЕДТА (47), который также индуцирует образование свободного ЛПС (48). Rossi с соавторами (49) показали возможность образования комплекса кальция с ЛФ, что приводило к освобождению ЛПС из стенки Грам-отрицательных бактерий без прямого контакта молекулы ЛФ с бактерией.

Молекулярный механизм действия ЛФ на Грам-положительные микроорганизмы, видимо, похож на действие других катионных антибактериальных пептидов. Такие пептиды взаимодействуют с клеточной стенкой по ионному механизму, связываясь с отрицательно заряженным липидным матриксом, и разрушают неполярный слой мембраны в результате гидрофобных взаимодействий (50,51). Было установлено, что участок ЛФ, который определяет его бактерицидную активность против Грам-положительных микроорганизмов, располагается в N-концевой части, где несколько гидрофобных аминокислотных остатка соседствуют с положительно заряженными аминокислотами (41) – такая структурная последовательность встречается в молекулах ЛФ из различных животных. Более того, выделенный N-концевой фрагмент различных ЛФ-нов обладает многократной, по сравнению с нативной молекулой, железо-независимой бактерицидной активностью против Грам+ и Грам- бактерий (52,54).

Антибактериальная активность ЛФ, которая определяется его протеиназной активностью.

Неожиданная новая биохимическая активность, которая была открыта для ЛФ сравнительно недавно, заключается в том, что этот белок обладает протеолитической активностью по отношению к ряду вирулентных микробных факторов, уменьшая, таким образом, патогенность бактерий. Исследователи наблюдали деградацию вирулентного белка патогена H. influenzae IgA1, когда культивировали этот микроорганизм в молочной среде (55). В дальнейшем, Qiu с соавторами показали, что ЛФ гидролизует не только белок IgA1, но и микробный фактор адгезии Нар, причем лактоферрин в этом случае функционирует, как сериновая протеиназа (56) с активным центром, который располагается в N-концевой доле белка. При инкубации H. influenzae с человеческим ЛФ большая часть белка IgA1, которая связана с мембраной микроба, ферментативно отщепляется (57), причем в месте гидролиза этого вирулентного фактора находятся в основном остатки аргинина (58). Как установили Ochoa и Cleary, протеолитическая активность рекомбинантного чЛФ подавлялась классическими ингибиторами сериновых протеиназ (59). Эти же авторы показали, что обработка белком ЛФ бактерии Shigella Flexneri 5, штамм M90T, приводила к ингибированию проникновения микроорганизма в клетки хозяина. Оказалось, что ЛФ гидролизовал два белковых плазмидных антигена В и С (IpaB и IpaC) этой бактерии (61,62), которые отвечают за процесс интернализации этого микроорганизма. Белок ЛФ также блокирует адсорбцию энтеропатогенной E. сoli, процесс гемолиза и индукции полимеризации актина в клетках HEp2, вызывая деградацию специальных секреторных белков E. Сoli А, В, и С (63,64).

Massucci и соавторы (65) изучали протеолитическую активность ЛФ с использованием синтетических пептидов. Они установили, что субстратная специфичность ЛФ совпадает со специфичностью трипсина, а ингибиторы сериновых протеиназ подавляют протеиназную активность ЛФ. При этом каталитические параметры ЛФ (kcat, Km) оказались на несколько порядков ниже, чем у трипсина. С помощью аффинной хроматографии был установлен интересный факт, что только 10% молекул ЛФ обладают протеиназной активностью – этот результат подтвердил Antonini в своих работах с рекомбинантным ЛФ (91). Тем не менее, активный протеиназный активный центр молекулы ЛФ до сих пор не идентифицирован.

В заключении надо отметить, что низкие каталитические константы при гидролизе синтетических субстратов и неустановленная структура активного центра требуют дальнейшего молекулярного исследования ЛФ перед тем, как определять физиологическую целесообразность протеиназной активности ЛФ в экспериментах с лабораторными животными.

Влияние на бактериальную агрегацию и образование биопленок.

Современное дополнение к уже известным свойствам ЛФ является открытие ингибирования лактоферрином бактериальной агрегации и образования биопленки. Эта активность может проявляться при защите организма от легочных и оральных инфекций.

ЛФ и респираторные заболевания.

Пневмофиброзы, как и нарушения метаболического транспорта ионов хлорида и натрия, являются результатом очень высокой концентрации железа в легочной жидкости (при среднем значении 6.3 x 10–5 M) (66). Такое повышение уровня железа с одной стороны, индуцирует образование оксид-радикалов (ROS), которые приводят к серьезным легочным заболеваниям, а с другой, усиливает рост и колонизацию Pseudomonas aeruginosa и Burkholderia cepacia - двух подвижных Грам-отрицательных патогенов, которые являются основными агентами, вызывающими заболеваемость и смертность пациентов с легочными фиброзами. Образование биопленки этими бактериями является основным вирулентным фактором. Пептиды и белка неиммунной защиты организма, включая ЛФ, являются основными компонентами защиты в случае таких заболеваний. Современные исследования привели к открытию того, что апоформа белка ЛФ, образуя хелатную связь с железом, ингибирует сорбцию P. aeruginosa и формирование биопленки путем активации специфических движений ворсинок этого микроорганизма (67). Подобно P. aeruginosa, ряд штаммов B. cepacia также не могут образовывать колонии в среде с пониженным уровнем железа. С другой стороны, избыток железа, или добавление комплекса ЛФ-Fe, индуцирует образование биопленок бактериями P. aeruginosa и B. сepacia (68).

Отмечается, что в организме больных с пневмофиброзами и хроническими бронхитами ЛФ не может проявлять эту защитную функцию (69). Установлено, что концентрация ЛФ в мокроте таких больных возрастает с усилением инфекции и воспаления (70), но, также возрастает уровень железа (до 6.3 x 10–5 M), который насыщает ЛФ (1 x 10–5 M) и инактивирует его способность подавлять образование биопленки (67,68). Защитные свойства ЛФ могут также модулироваться при высоких концентрациях NaCl в секрециях дыхательных путей пациента, или под действием протеиназ бактерий, которые чрезвычайно активны при легочных инфекциях (71).

В области инфекции или воспаления рН среды, обычно снижается (меньше 4.5) в результате жизнедеятельности патогена или в результате метаболической активности лейкоцитов. Но даже при этом рН молекула ЛФ сохраняет высокую специфичность к ионам железа и может связывать металл, освобождающийся из неустойчивого в таких условиях комплекса трансферрин-Fe.

Эти результаты позволяют говорить о функциях белка ЛФ в секрециях слизистой и их модуляции, связанной с уровнем насыщения молекулы ЛФ железом.

Лактоферрин и оральные инфекции.

Среди секреторных жидкостей слюна является еще одной биомоделью для изучения влияния железа и ЛФ на бактериальную агрегацию и образование биопленок. В человеческой слюне уровень железа находится в интервале 0.1 - 1.0 ?M в зависимости от питания, тогда, как физиологическая концентрация ЛФ варьирует от 5 до 20 мкг/мл и достигает 60 мкг/мл во время инфекционного процесса. В ротовой полости основным агентом патогенеза является Streptococcus mutans, который приводит к кариесу через адгезию и агрегацию на эмали зубов. В настоящее время показано, что апоформа ЛФ стимулирует агрегацию S. mutans, тогда, как насыщенный железом ЛФ ингибирует формирование биопленки (72). Эти факт объясняется тем, что в слюне устойчивых к кариесу пациентов процесс очищения от патогенов осуществляется через агрегацию микроорганизмов без их деления, что и приводит к подавлению формирования биопленки. Апоформа ЛФ также индуцирует агрегацию анаэробной Грам-негативной бактерии Porphyromonas gingivalis, которая ассоциирована с развитием пародонтозов (73). В случае острого развития этого заболевания у пациентов в слюне наблюдается высокий уровень железа и присутствие гемина, что приводит к насыщению ЛФ железом и его протеолитическую деградацию под действием бактериальных ферментов (74), что приводит к потере защитных свойств этого белка в ротовой полости. Различный эффект окружающей среды с дефицитом железа на подвижность, агрегацию, и образование биопленок такими патогенами, как S. mutans, P.gingivalis, P. Aeruginosa, и B. Cepacia, указывают на важность бактериальной этиологии и экспрессии вирулентности среди различных микробных патогенов.

В настоящее время Weinberg установил, что человеческий ЛФ, трансферрин, и 6 других низкомолекулярных хелатирующих агента могут быть использованы, как природные ингибиторы образования биопленки. Этим исследователем было показано, что процесс формирования биопленки у большинства микробов находится в прямой зависимости от концентрации железа, которое необходимо для роста бактерии (75).

На основании этих данных можно утверждать, что различие в реагировании микроорганизма на изменения в окружающей среде и молекулярные механизмы увеличения плотности бактерии зависят от таких факторов, как уровень железа и содержание различных молекулярных форм ЛФ – апоформы и железонасыщенный белок.

Абиогенные поверхности.

Микробиологическая адгезия и последующая колонизация и образование биопленки на небиологические поверхности, например, хирургический и медицинский инструмент, является серьезной проблемой приводящей к различным заболеваниям и воспалениям. Основной подход для решения этой проблемы заключается в создании новых композиционных материалов, которые обладают минимальной специфичностью к сорбированию микрофлоры. В связи с этим, очень привлекательной выглядит возможность использования ЛФ, как нового компонента, защищающего поверхность от микробиологической адгезии. Например, показано, что обе формы ЛФ (комплекс с железом и апоформа) ингибируют адгезию бактерии S. mutans на гидроксиапатите (НА, имитатор зубной поверхности) (76). Было установлено, что эта новая активность ЛФ определяется последовательностью 473-538 из С-концевой половины белка (77), которая не участвует в связывании железа.

При покрытии ЛФ-ном синтетического полимера антиагрегационная активность этого белка против S. mutans сохраняется (72). Интересно, что только апоформа белка ингибирует сорбцию бактерии Prevotella nigrescens на НА (78). В другом исследовании показано, что человеческий ЛФ ингибирует адгезию Actinobacillus actinomycetemcomitans и Prevotella intermedia на искусственную мембрану (Matrigel) через ионные взаимодействия с бактериальными адгезивными факторами (79). В практическом аспекте покрытие ЛФ-ном глазных линз приводит к защите их поверхности от P. aeruginosa (80).

Различная природа небиологических поверхностей определяет различия в молекулярных механизмах прикрепления микроорганизмов, что объясняет разнообразие активностей обоих форм ЛФ. Иногда молекула ЛФ взаимодействует с поверхностью по ионному механизму и конкурирует с бактерией при ее сорбировании, но в некоторых случаях ЛФ непосредственно взаимодействует с мембранными структурами микроорганизма и нарушает его адгезивные свойства.

Клеточные поверхности.

Способность бактерии к адгезии и формировании биопленки на клетках хозяина является ключевым этапом в развитии и обострении инфекции. С другой стороны, высокая резистентность микробной биопленки к природным защитным свойствам организма и антибиотикам требует открытия новых эффективных антисорбционных агентов. Подавляющее большинство Грам-отрицательных и Грам-позитивных бактерий синтезируют специальные молекулы адгезины, которые участвуют в процессе прикрепления микроорганизма на клетках. Уже известно, что лактоферрины и лактоферрицины взаимодействуют с поверхностью различных бактерий (36) и с мембранами клеток хозяина через глюкозаминогликаны (GAGs) (81) и гепаран сульфат (HS) (82), и, вместе с тем, появляются работы, которые указывают на новые механизмы ЛФ, определяющие его антиадгезивные свойства.

Впервые защитная активность ЛФ против бактериального заражения слизистой была показана для E. coli HB101 несущей ген инвазин (Yersinia pseudotuberculosis inv). Продукт этого гена отвечает за связывание бактерии с клетками и прохождения патогена в цитозоль (83). Преинкубация клеток или микроорганизма с ЛФ защищает клетки от интернализации, но не от адгезии E. Coli с клетками. В для E. coli HB101 (pRI203), Y. Pseudotuberculosis и Y. enterocolitica показано, что ЛФ, независимо от присутствия железа, взаимодействует с клетками-мишенями и вирулентными факторами инвазинами, и ингибирует связывание и проникновение микроорганизмов в клетку (83, 84). Такой же эффект ЛФ оказывает на рецепцию энтеротоксичной E. coli (ETEC) с эпителиальными и кишечными клетками (85), трех штаммов E. coli(DAEC), вызывающих диарею, энтероагрегативный штамм E. coli (EAEC) (86), и энтеропатогенную E. coli (EPEC) (87).

Функциональная значимость гликозидной части молекулы ЛФ показана в опытах с адгезией бактерии Shigella spp (88). Природный чЛФ ингибировал колонизацию патогена, тогда, как рекомбинантный чЛФ, с отличной от нативного белка гликозидной структурой, такой эффект против бактерии не проявлял (61). Актуальный интерес вызывают работы, где чЛФ, рекомбинантный чЛФ и ЛФ коровы защищали желудочный эпителий от взаимодействия с Helicobacter felix путем связывания бактериальных адгезинов с олигоманнозными антеннами белка ЛФ (89).

Процесс ингибирования адгезии бактерии на клеточной мембране определялась как взаимодействием ЛФ с клетками, так и с микроорганизмом, но открытие протеолитической активности молекулы ЛФ (56) позволило установить дополнительные механизмы подавления сорбции патогенов. Так, для штаммов энтеропатогенной E. coli продемонстрировано, что ЛФ гидролизует и инактивирует секреторные белки EspA, B, D (63), которые при обычных условиях инъецируются в клетку и убивают ее. В случае с H. influenzae и A. actinomycetemcomitans ЛФ разрушает два бактериальных адгезирующих фактора и транспортные белки соответственно (57,58,90) что нарушает процесс адгезии. По-видимому, преинкубация ЛФ с клетками, что приводит к связыванию этого белка с мембранными молекулами GAGs или HS, не является обязательным при ингибировании адгезии Грам+ и Грам- бактерий. Многочисленные эксперименты демонстрируют, что наиболее важен контакт ЛФ непосредственно с бактерией с последующей сорбцией на мембране микроорганизма. После этого ЛФ гидролизует такие вирулентные факторы, как адгезины и белки секреторной системы патогена. Некоторые исследователи рассматривают третий путь, когда ЛФ связывается и с клетками хозяина, и с бактерией.

Ингибирование лактоферрином проникновения микроорганизма в эпителиальные клетки.

Ряд патогенных бактерий после адгезии на клетках, например, на эпителиальных клетках хозяина, проникают в цитозольное пространство, что позволяет микроорганизму расти и размножаться без риска стать целью защитных механизмов организма. Мембранные вирулентные факторы бактерии являются ключевыми элементами, способствующие проникновению патогена в клетку. ЛФ, как сейчас установлено, является мощным протектором, защищающим клетки организма от инвазии Грам+ и Грам- микроорганизмов. Более того, ЛФ защищает клетки от интернализации некоторых паразитов (см. ниже).

Впервые этот защитный эффект был показан для штамма HB101E. coli (pRI203) (83). Перед проникновением в клетку этой бактерии необходимо, чтобы микробный белок инвазин связался с клеточным рецептором интегрином. ЛФ связывается с обоими белками и, таким образом, прерывает процесс внедрения (83,84). Этот же эффект был получен для патогенов Y. enterocolitica и Y. рseudotuberculosis с использованием лактоферрицина - при максимальной экспрессии инвазина ЛФЦ связывал до 10% молекул этого белка и ингибировал процесс инвазии (84). Установлено, что связывание инвазина с ЛФ и ЛФЦ происходит по доменам, которые отвечают также за связывание ЛФ клеточными GAGs, в связи с чем, ряд ученых высказывают мнение, что ЛФ, выступая в роли связующего мостика, способствует необычному контакту бактерии с клеткой, что и подавляет интернализацию патогена (84).

По схожему механизму подавляется внедрение в клетки хозяина таких Грам позитивных бактерий, как L. monocytogens, Streptococcus pyogenes (GAS) и Staphylococcus aureus. В этом случае ЛФ (с железом или без) связывает с одной стороны бактериальные адгезины, а с другой – взаимодействует с клеточными мембранами (91-93). Способность ЛФ подавлять таким образом инфекцию GAS эффективно доказана в клиническом испытании in vivo на детях с фарингитами, которым было рекомендовано хирургическое удаление гланд (92). Рекомбинантный чЛФ не действует на процесс внедрения бактерии S. flexneri, но индуцировал клетки секретировать защитные факторы, которые гидролизовали вирулентные молекулы патогена IpaB и IpaC, отвечающие за интернализацию (61). При низкой концентрации железа коровий ЛФ активирует синтез вирулентных факторов IpaB и IpaC у E. coli (EIEC) – это указывает на то, что присутствие ЛФ и его хелатирующей способности может быть своего рода сигналом для определенных метаболических изменений у патогенной бактерии способствующих процессам ее интернализации (94). И, наконец, ЛФ проявляет необычный механизм подавления интернализации против A. Actinomycetemcomitans, инактивируя белок-транспортер Аае, который является медиатором при связывании патогена с эпителиальными клетками (90).

Во всех исследованиях с внутриклеточными микроорганизмами установлено, что ЛФ, независимо от насыщения железом, подавляет процессы интернализации бактерии в клетку-мишень.

В сравнении с процессом ингибирования адгезии, связывание ЛФ с клеточными GAGs является критическим при подавлении проникновения бактерии в клетку. Более того, появились работы, где предполагается транспорт ЛФ в ядро клетки хозяина (лейкоциты, эпителиальные клетки), что приводит к активации специфических генов (95). Это может приводить к изменению клеточного метаболизма с перестройкой ее цитоскелета, что может нарушать механизм интернализации бактерии. Для сравнения, установлено, что чТФ может поникать в клетки организма, но этот белок не проявляет защитных функций, свойственных ЛФ (95).

Ингибирование вирусных инфекций лактоферрином.

Впервые антивирусная активность ЛФ была отмечена для мышей зараженных вариантом вируса Фрейда, вызывающим полицитемию (эритроцитоз) (96). С 1994 г. антивирусная активность ЛФ, который выделялся из различных организмов, показана как для голых вирусов, так и для вирионов с дополнительной оболочкой. Изложенные ниже данные являются простым изложением некоторых результатов о связывании ЛФ с вирусными поверхностными белками или/и клетками-мишенями.

Цитомегаловирус (ЦМВ).

Эксперименты In vitro показывают, что ЛФ подавляет вирус ЦМВ по железонезависимому механизму и без использования гликозидной части (97). Подавление позитивного заряда ЛФ с помощью химической модификации белка, приводило к потере антиЦМВ активности модификации и, наоборот, добавление позитивных зарядов молекуле ЛФ приводило к усилению его активности (98). В исследованиях in vivo введение ЛФ до инфицирования вирусом ингибировало ЦМВ и полностью защищало лабораторных животных от инфекции от гибели (99), при этом наблюдалось усиление активности, NK клеток. В других работах, при заражении животных с иммуносупрессией, 4-х недельное введение ЛФ вызывало 10-кратное уменьшение титра вируса (100). Эти результаты демонстрируют, что в случае ЦМВ антивирусная активность ЛФ определяется тем, что ингибируются процессы внедрения вируса, но сам ЛФ не активирует иммунную систему организма.

Вирус герпеса (HSV).

Начальный этап внедрения вируса герпеса в клетку заключается во взаимодействии вирионных гликопротеинов (gC или gB) с гепаран сульфатом (HS) клетки-мишени. При отсутствии HS, вирусная частица может связываться с мембранным хондроитином или протеогликаном, но с меньшей специфичностью (97). Независимо от уровня железа или содержания остатков сиаловой кислоты в гликозидной части молекулы, ЛФ из различных животных ингибируют инфицирование частицами вируса герпеса и его репликацию в экспериментах с эмбриональными человеческими клетками (97). В других работах показано, что комплексы ЛФ с такими металлами, как марганец и цинк также ингибируют инфекцию через связывание лактоферрином вирусных частиц (101, 102). Пептиды, полученные из С-концевой доли ЛФ (остатки 345-689) и из N-концевой области (остатки 1-280) защищают клетки от внедрения вируса герпес по аналогичному с нативным ЛФ механизму, тогда, как небольшой пептид 86-258 демонстрирует другой механизм (103, 104).

В настоящее время получены результаты, указывающие на то, что ЛФ ингибирует инфекцию герпеса связываясь с клеточными глюкозаминогликанами (GAG) или с поверхностными HS и хондроитином, конкурируя с вирусными частицами (105). Если клетки дефицитны по содержанию молекул GAG на своей поверхности, то защитные свойства ЛФ ослабевают. Более того, при использовании вирусов – мутантов по поверхностному гликопротеину С (gC) действие ЛФ также ослабевает, что указывает на конкуренцию между gC вируса герпеса и ЛФ за взаимодействие с клеточными GAG. Введение 1% раствора ЛФ перед вирусной инокуляцией приводит к полной супрессии инфекции, но не ингибирует репродукцию вируса гепатита (106).

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) .

Природная форма ЛФ (10-20% насыщения железом) ингибирует цитопатогенез, вызываемый вирусом ВИЧ1. Увеличение негативного заряда молекулы ЛФ путем химического сукцинирования усиливало ингибирование инфекций ВИЧ1 и ВИЧ2, тогда как положительный дополнительный заряд приводил к потере этой активности ЛФ (98, 107). Нативный и модифицированный ЛФ прочно связываются с петлей V3 вирусного гликопротеина gp120, входящего в состав оболочки ВИЧ. Это приводит к ингибированию взаимодействия вируса с клеткой и его проникновения в цитозольное пространство (108).

Кроме этого, репликация ВИЧ также подавлялась апоформой лактоферрина и его насыщенными комплексами с Fe3+, Mn2+ и Zn2+, причем белок добавлялся перед инфицированием или непосредственно на стадии адсорбции вириона на клетках (108). В настоящее время показано, что лактоферрицин также ингибирует ВИЧ инфекцию (109).

Вирусы человеческого гепатита С (HCV) и гепатита Б (HBV) .

ЛФ эффективно защищает клеточную культуру человеческих гепатоцитов от инфекции HCV. ЛФ непосредственно взаимодействует с вирусной частицей поверхностные белки Е1 и Е2 (110). Именно поэтому, преинкубация ЛФ с вирусом приводит к ингибированию инфекции, тогда, как преинкубация с клетками не защищало от сорбции вирусных частиц (111).

Лактоферрин также подавляет инфекцию гепатита Б при использовании соответствующей клеточной линии. В этом случае преинкубация ЛФ с клетками является обязательным условием для проявления ингибиторного эффекта (112). В настоящее время ЛФ рассматривается как очень перспективный терапевтический агент для эффективного лечения хронических гепатитов.

Ротавирусы.

Апо- и железонасыщенная формы ЛФ подавляют репликацию ротавирусов, причем апоформа белка более эффективна. ЛФ предотвращает связывание вириона с клеткой-мишенью, взаимодействуя с вирусной частицей, что предотвращает, помимо абсорбции вируса на клетке, гемагглютинацию ротавируса. Более того, синтез вирусных антигенов и выход ротавируса из зараженных клеток кишечника также ингибируется ЛФ, когда его добавляли в течение первых часов инфекции (113), что указывает на важность присутствия ЛФ на начальных этапах инфекции.

Дегликозилирование молекулы ЛФ усиливает его антиротавирусную активность, тогда, как насыщение ЛФ-на ионами марганца или цинка ослабевали эту активность. Пептиды ЛФ, полученные в результате протеолиза (остатки 86-258 и 324-329) также подавляют ротаинфекцию, но с меньшей активностью, чем нативный белок (114).

Аденовирусы.

Человеческий и коровий ЛФ, его природная и апоформа, а также насыщенные комплексы ЛФ с Fe3+, Mn2+ и Zn2+, добавленные до или после инфекции, или во время репликативного периода вируса, эффективно подавляют аденовирусную инфекцию первого типа (115). Сорбции на клетках хозяина аденовирусов 2 типа происходит через клеточный гепаран сульфат (HS) (112), поэтому участок ЛФ, располагающийся в N-концевой доле белка и обладающий высокой аффинностью к HS, является конкурентом абсорбции вирусных частиц. Показано, что пептид лактоферрицин также проявляет антиаденовирусную активность (117). Изучения белков вирусной оболочки выявили два структурных полипептида 86 и 66 kDa, которые эффективно связывались лактоферрином – эти белки соответствовали вирионным антигенам III и IIIa, которые взаимодействуют с клеточным рецептором интегрином перед интернализацией аденовируса (118). Именно инактивация аденовирусных поверхностных белковых антигенов III и IIIa определяет в данном случае антивирусную активность лактоферрина.

Фунгицидная и антипаразитическая активности ЛФ.

В in vitro экспериментах ЛФ из различных организмов, как и пептиды лактоферрицины, обладают активностью против человеческих патогенных грибковых заболеваний и, в первую очередь, таких, как Candida albicans и ряд других видов Candida. Однако концентрация ЛФ для проявления этой активности должна быть намного выше, чем для известных антигрибковых препаратов. Это можно объяснить тем, что условия экспериментов in vitro сильно варьируют в разных лабораториях, а также использованием различных субпопуляций фитопатогена (32, 119-121). К настоящему времени достоверно установлено, что ЛФ является фунгицидом для шести Candida видов, причем уровень активности различается в следующем порядке: C. tropicalis > C. krusei > C. albicans > C. Guilliermondii > C. parapsilosis > C. Glabrata (120). Фунгицидные свойства ЛФ определяются его непосредственным взаимодействием с патогеном, но не способностью связывать свободное железо (122). Такое взаимодействие приводит к разрушению клеточной стенки и гибели фитопатогена (120,123,124). В современных работах указывается на важность ионного состава среды и стадии метаболического развития Candida для проявления антикандидозных свойств ЛФ (125). При экспериментальных кандидозах также наблюдается механизм взаимодействия ЛФ с клетками хозяина, что, видимо, также необходимо для проявления антимикотических активностей этого белка (126).

Молекулярные механизмы, определяющие антипаразитические свойства ЛФ, чрезвычайно сложные и неоднозначные. К примеру, способность ЛФ связывать железо подавляет развитие ряда паразитов, как Pneumocystis carinii (127,128), а в случае с другими патогенами ЛФ выступает как специфический донор железа (Tritrichomonas foetus). В последнем случае ЛФ в комплексе с железом может даже усиливать инфекцию (129). В недавних работах показано, что паразит Trypanosoma brucei, который может связывать трансферрин и ЛФ через два своих поверхностных белка, подавляется лактоферрицином, как и паразит Eimeria stiedai. Преинкубация спорозоидов этих патогенов с пептидными производными лактоферрина приводит к защите клеток животных от заражения в экспериментальных моделях in vitro и in vivo (131).

Атипаразитическая активность ЛФ иногда определяется взаимодействием этого белка с клетками хозяина, например, железонасыщенный ЛФ активирует макрофаги, которые убивают Trypanosoma сruzi на стадии амастиготы (132), а также ингибирует внутриклеточное развитие Plasmodium falciparum в эритроцитах (133).

Ингибирование процесса заражения клеток спорозоитами Plasmodium spp. происходит при специфическом связывании ЛФ с поверхностным гепаран сульфатом (HS) (134), что подавляет взаимодействие сорбционного антигена паразита (белок CS) с клеточной мембраной. Более того, ЛФ может непосредственно связывать рецептор-мишень антигена CS (рецептор подобный белок LRP) и защищать от абсорбции спорозоитов клетки хозяина, которые не содержат гепаран сульфат (135).

Заключение.

Защитные свойства ЛФ против микробных и вирусных инфекций продемонстрированы во многих научных работах и к настоящему времени известно о проведении несколько клинических испытаний терапевтических препаратов на основе этого белка. Тем не менее, наши современные знания позволяют определить ЛФ не только, как ключевой компонент первичной защитной системы организма, но и как многофункциональный регуляторный фактор, который взаимодействует и влияет на микробные, вирусные или клеточные компоненты, вовлеченные в процесс инфекции.

Дополнительно к бактериостатическим свойствам ЛФ, которые определяются его способностью связывать железо, открыто много других активностей и механизмов действия этого белка на бактерии и вирионы. При секреции на слизистую ЛФ в достаточно небольших концентрациях модулирует подвижность патогенного микроорганизма и ингибирует его способность к агрегированию и образованию биопленки. Различия в уровне свободного железа, локализации бактерии и ее специфичности к различным органам определяют различные механизмы действия ЛФ на абсорбцию патогена. Например, для S. mutans в присутствии природного или апоЛФ клеточная плотность для формирования микробных агрегатов достигается без деления бактерий и такие агрегаты инактивируются в слюне ротовой полости, тогда как для P. аeruginosa и B. сepacia деление клеток необходимо для агрегирования и только апоформа ЛФ препятствует этому.

ЛФ ингибирует образование биопленок на абиогенных поверхностях путем ионного взаимодействия с этими поверхностями и/или прямого связывания с микробом. Сорбция бактерии на мембране клетки-хозяина является важнейшим этапом развития инфекции, что приводит к росту и развитию микроорганизма, его размножению и образованию биопленок, устойчивых к иммунной защитной системе организма, фагоцитозу и антибиотикам. Выделяемые микроорганизмами токсины разрушают эпителий и вызывают распространение заболевания. ЛФ ингибирует абсорбцию бактерий на клетках хозяина и останавливает распространение патогена в организме, проявляя в этом случае антивирулентную активность. Экспериментальные данные указывают на то, что в процессах ингибирования сорбции микроорганизма очень важен непосредственный контакт ЛФ с Грам+ или Грам-негативным патогеном. ЛФ в дальнейшем может гидролизовать или модифицировать вирулентные факторы бактерии (адгезины, белки секреторной системы), что приводит к их инактивации

Следующий важный этап инфекции – интернализация микроба внутрь клетки, также может модулироваться лактоферрином, но в этом случае критическим является взаимодействие молекулы ЛФ с поверхностными клеточными элементами глюкозаминогликанами. Более того, показана возможность проникновения самого ЛФ в ядро клетки хозяина, что приводит к активации ряда генов и ингибированию сорбции и интернализации патогенной бактерии.

В заключении, противовирусная активность ЛФ, определяемая его способностью конкурентно связывать клетки-мишени и/или вириоидные частицы, позволяет отнести ЛФ к ключевым элементам врожденной системы защиты организма от атак болезнетворных микроорганизмов и вирусов.

Список литературы: