|
Определение полной первичной структуры геномов трех изолятов, полученных на разных стадиях пассирования штамма NADC-8 вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней
 Вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней (РРСС) вызывает различные нарушения функции воспроизводства у свиноматок и респираторные нарушения в основном у поросят.
Вирус РРСС относится к роду Arterivirus, семейству Arterividae, отряду Nidovirales. К этому роду также относятся вирус артерита лошадей (equine arteritis virus), вирус повышения уровня лактатдегидрогеназы мышей (lactate dehydrogenase-elevating virus of mice) и вирус геморрагической лихорадки обезьян (simian hemorrhagic fever virus). Быстрому распространение вируса способствует его длительная персистенция в зараженных животных, присутствие в сперме, высокая контагиозность. Геном вируса РРСС представлен одноцепочечной молекулой РНК положительной полярности, состоящей из 15,1 тыс. нуклеотидов. Он имеет 8 трансляционных рамок (ORF). Из них ORF 1a и ORF 1b кодируют неструктурные белки, входящие в полимеразный комплекс, ответственный за репликацию и транскрипцию вирусного генома. Структурные белки кодированы рамками ORF2-ORF7. В ходе транскрипции генов структурных белков образуются 6 перекрывающихся молекул мРНК разной длины с общей 3’-концевой частью и с общей лидерной последовательностью на 5’-конце. Вирулентный штамм NADC-8, ослабленный вариант NADC-8 (251) и ревертировавший к дикому типу изолят NADC-8 (252p) были получены в Национальном центре болезней животных (NADC) США в штате Айова, в лаборатории В. Менгелинга. Штамм NADC-8 (251) был получен методом серийного пассирования штамма NADC-8 в перевиваемой культуре клеток почек обезьяны 251 раз. Поскольку эффективность роста вируса возрастала с количеством пассажей, то разведение при пассировании менялось от 1:5 в ранних до 1:50000 в поздних пассажах. Вирус из пассажа 251 был использован для заражения свиней и выделен из одного животного через 4 недели (84 расчетных цикла репликации) под именем NADC-8 (252p). В данной работе мы определили нуклеотидную последовательность геномов у трёх описанных изолятов, всего более 45 тыс. нуклеотидов, с целью выявить изменения в первичной структуре, потенциально связанные с наблюдаемыми фенотипическими изменениями (степень вирулентности и адаптация к клеточной культуре). Для амплификации и секвенирования геномных последовательностей было синтезировано более 150 олигонуклеотидных праймеров. Геномы были амплифицированы в виде перекрывающихся фрагментов, которые были очищены и напрямую секвенированы с 2-6 кратным перекрыванием на 2 цепях. Концевые последовательности геномов амплифицированы и клонированы в E.coli, после чего секвенированы в 10-15 клонах каждый. Проводится анализ полученных результатов. При сравнении изолятов NADC-8 и NADC-8 (251) обнаружен ряд аминокислотных и нуклеотидных замен, накопленных за 251 пассаж. К настоящему времени обнаружены две аминокислотные замены между изолятами NADC-8 (251) и NADC-8 (252p). Обе найдены в структурных белках в областях ORF2 и ORF6 и представляют собой возврат к дикому типу, т.е. обе аминокислоты совпадают у изолятов NADC-8 и NADC-8 (252p). Примечательно, что среди структурных белков не найдено других аминокислотных замен, несмотря на высокую генетическую изменчивость данного вируса. В нашем распоряжении имеется еще набор из 3 изолятов штамма NADC-9 вируса РРСС, независимо полученных параллельно с тремя описанными изолятами в том же режиме. Для них проведено частичное секвенирование геномов в области ORF2-ORF7. Примечательно, что и там обнаружено именно 2 замены с возвратом к дикому типу, в областях ORF2 и ORF6. При этом точные координаты замененных аминокислот не совпадают. В дальнейшей работе планируется экспериментально проверить закономерность возникновения найденных (и других) мутаций в связи с изменениями вирусного фенотипа.
|
|
