НАУЧНЫЕ РАБОТЫ/

	Применение молекулярных методов в диагностике и профилактике вирусных болезней свиней Забережный А.Д. доктор биологических наук
	Алипер Т.И. доктор биологических наук, директор группы компаний НАРВАК

Создание диагностических препаратов на основе молекулярных технологий

Лабораторные методы диагностики вирусных болезней свиней как правило основаны на выявлении вирусных антигенов, вирус-специфических антител или вирусных нуклеиновых кислот. Молекулярные методы находят все большее применение в диагностике.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Этот молекулярный метод выявляет нуклеиновые кислоты вирусов в биологических пробах. Во время вспышки классической чумы свиней (КЧС) в 1997 г. в Европе на основе обширной статистики была подтверждена диагностическая ценность ПЦР для данной инфекции. Разработанная в НПО НАРВАК система определения РНК вируса КЧС на основе ПЦР является универсальной и позволяет дифференцировать РНК вируса КЧС от других пестивирусов (вируса диареи крупного рогатого скота) и от других патогенов (как вирусной, так и бактериальной природы).

Метод ПЦР также дает убедительные результаты при выявлении и дифференциации возбудителя репродуктивного и респираторного синдрома свиней (РРСС) и является признанным диагностическим тестом в Европе и теперь в нашей стране.

Методом ПЦР можно выявлять цирковирусы свиней 2 типа, которые вызывают синдром пост-отъемного истощения поросят. Однако для постановки диагноза недостаточно выявить сам цирковирус, следует посмотреть также антитела к нему, а лучше всего, провести иммунохимическое окрашивание срезов лимфоузлов. Иными словами, для одних инфекций ПЦР может дать окончательный вердикт, а для других - служить подтверждающим методом при постановке диагноза.

ПЦР в реальном времени

Данный метод принципиально не отличается от ПЦР по сфере своего применения и интерпретации результатов. У него повышена надежность и степень автоматизации (рис.1). Поэтому он сочетает в себе достоинства ПЦР (чувствительность) и ИФА (технологичность), что позволяет применять его так, как сегодня применяют ИФА – для массового анализа проб.

Особенность полимеразной цепной реакции в реальном времени - возможность регистрации результата ПЦР в процессе реакции, в каждый момент времени. Регистрируя интенсивность флуоресценции, исследователь может узнать о ходе реакции без дополнительной стадии – электрофореза. Существенным преимуществом является то, что регистрация происходит в закрытой пробирке, т. е. полностью исключается контаминация.

Разработка иммуноферментного анализа для определения антител к вирусу КЧС и субъединичное вакцинирование при помощи рекомбинантного белка Е2

Рекомбинантный главный поверхностный гликопротеин Е2 из вакцинного штамма КС, а также из вирулентного штамма Ши-Мынь, был синтезирован в культуре клеток насекомых, используя бакуловирус в качестве экспрессирующего вектора. Уровень экспрессии Е2 достигает 5-10 мкг на 106 клеток. Продукт экспрессии был очищен методом афинной хроматографии, а его специфичность была подтверждена в иммунохимических реакциях с рядом референтных моноклональных антител (МАТ). Показана возможность использования данного продукта для определения антител к вирусу КЧС методом конкурентного иммуноферментного анализа. На основе данной разработки выпущен набор «КЧС-Серотест». Исследованы протективные свойства рекомбинантного белка Е2 из вирулентного штамма Ши-Мынь вируса КЧС при иммунизации животных. Показано, что рекомбинантный белок Е2 в дозе 200 мкг предохраняет животных от заболевания после экспериментального заражения вирулентным штаммом ВКЧС.

Разработка отечественного иммуноферментного анализа для определения антител к вирусу РРСС на основе рекомбинантного белка нуклеокапсида

На основе гена ORF7 вирусов РРСС европейского и американского типов синтезированы рекомбинантные нуклеокапсидные белки вируса в разных системах: в бактериях и в клетках насекомых. Все варианты рекомбинантных продуктов были исследованы в качестве антигенов в непрямом твердофазном ИФА для выявления антител к вирусу РРСС. Цель синтеза различных антигенов заключалась в том, чтобы сделать диагностический набор наиболее универсальным – способным выявлять антитела к обоим типам вирусов, как к линейным, так и к конформационным антигенным эпитопам. Полученная тест-система проверялась на большой выборке сывороток свиней из хозяйств России и Белоруссии. Одновременно проводился молекулярно-эпизоотологический анализ изолятов вируса РРСС на указанных территориях методом компьютерного анализа структуры их генов. В результате подобраны антигены и условия для выявления антител к вирусу РРСС. Получены высокие коэффициенты корреляции с другими методами. На основе данной разработки выпущен набор «РРСС-Серотест».

Создание вирусных вакцин нового поколения на основе молекулярных технологий

Сегодня вакцины разрабатываются и на основе новых технологий, что приводит к созданию делеционных мутантов, живых вакцин на основе вирусных или бактериальных векторов, экспрессирующих чужеродные гены, субъединичных вакцин, а также ДНК-вакцин.

Живые вакцины на основе аттенуированных штаммов как правило обладают максимальной эффективностью при относительно невысокой стоимости. Однако не для всех инфекционных заболеваний создание живых вакцин представляет простую задачу. Трудность состоит в получении вирусного штамма, обладающего достаточной иммуногенностью, сниженной вирулентностью и генетической стабильностью. С появлением новых молекулярных методов эта задача может быть решена при помощи генных технологий. В последнее десятилетие в молекулярной генетике вирусов получило развитие новое направление: обратная генетика. В рамках данного направления возможен синтез in vitro инфекционных вирусных геномов и внесение в них целенаправленных мутаций. Иными словами, речь идет о создании вирусов с заданными свойствами. Первое практическое применение новых технологий направлено на создание новых вакцинных штаммов. В НПО НАРВАК получены рекомбинантные вирусы КЧС и РРСС на основе инфекционных геномов.

Создание нового вакцинного штамма вируса классической чумы свиней

В НПО НАРВАК с целью создания отечественной живой маркированнной вакцины молекулярными методами синтезирована инфекционная копия генома вакцинного штамма вируса КЧС. Вакцинный штамм КС, взятый за прототип в данной работе, получен на основе вакцинного штамма ЛК ВНИИВВиМ, который применялся в СССР на протяжении более 30 лет (проф. В.А.Сергеев). В 1997-2000 гг. было проведено детальное изучение биологических свойств и молекулярных характеристик данного вакцинного штамма: структура генома штамма КС была полностью определена, разработан молекулярный тест на основе ПЦР (ТУ-9388-082-00008064-99, 18.01.99 г.), а также на основе ПЦР и рестриктного анализа для выявления и дифференциации вирулентного и вакцинного штаммов. Поверхностные гликопротеины вируса КЧС были синтезированы в бакуловирусной системе, на их основе создан иммуноферментный тест для выявления вирус-специфических антител (ТУ-9388-082-00008064-98, 08.12.98 г.). Таким образом, были созданы все предпосылки для создания нового вакцинного штамма для разработки маркированной вакцины против КЧС.

С целью получения маркированного вакцинного штамма, был синтезирован гибридный рекомбинантный геном вируса КЧС, с замененным геном главного поверхностного гликопротеина Е2 на аналогичный ген вируса диареи крупного рогатого скота (ВД КРС) и на этой основе получен инфекционный гибридный вирус, способный к серийному размножению в культуре клеток свиного происхождения (линии клеток PK-15 и SK-6). Генно-инженерное происхождение гибридного вируса подтверждено молекулярным анализом. Замена главного поверхностного гликопротеина Е2 вируса КЧС на ген Е2 из вируса ВД КРС сопровождалась появлением цитопатогенного действия нового гибридного вируса. Предварительные эксперименты показывают, что новый штамм является иммуногенным и безвреден для свиней.

Приведенные результаты демонстрируют примеры комплексного применения молекулярных методов для создания диагностических и вакцинных препаратов применительно к вирусным болезням свиней.

Международное сотрудничество

Специалисты НПО НАРВАК в контакте с НИИ Вирусологии им. Д.И.Ивановского принимают участие в ряде международных проектов:
Молекулярное типирование изолятов вируса РРСС в странах СНГ, разработка ПЦР и получение рекомбинантных вирусных антигенов для диагностики
(Central Veterinary Laboratory, UK, Dr. T. W. Drew)
Изучение генетических детерминант вирулентности и создание инфекционной копии генома вируса РРСС
(National Animal Disease Center, Iowa, USA, Dr. W. L. Mengeling, Dr K. Lager)
Создание инфекционной копии генома вируса классической чумы свиней
(Plum Island Animal Disease Center, Iowa, USA, Dr. D. Rock)
Молекулярное типирование изолятов вируса классической чумы свиней в странах СНГ
(EU Reference Laboratory, Hannover, Germany, Dr. I. Greiser-Wilke