2010

Разработка и оценка антигенной активности рекомбинантной субъединичной вакцины против вирусной лейкемии кошек

Раев С.А.¹, Rob van Herwijnen ², Богданова В.С.⁵, Грабовецкий В.В.⁵, Забережный А.Д.⁵, Верховский О.А.⁴, Непоклонова И.В.⁴,  Алипер Т.И.³, Мухин А.Н.³, Орлянкин Б.Г.,⁴Непоклонов Е.А.¹

 

¹ Московский государственный университет прикладной биотехнологии

² Европейская ветеринарная лаборатория (Нидерланды)

³ ЗАО «НПО НАРВАК»

⁴ АНО «Научно-исследовательский институт диагностики и профилактики болезней человека и животных»

⁵ ГУ НИИ Вирусологии им. Д.И. Ивановского

 

 

Введение

Вирусная  лейкемия кошек является одним из наиболее распространенных инфекционных заболеваний кошек. Возбудитель – вирус лейкемии кошек (Feline leukaemia virus, FeLV или ВЛК). Это РНК-содержащий вирус семейства Retroviridae. Существует четыре подгруппы ВЛК (A, B, С и T). Наличие нейтрализующих антител к вирусу подгруппы А является критерием устойчивости организма животного к данному заболеванию. ВЛК вызывает неопластические процессы в клетках гемопоэтического ряда, а также  дегенеративные и пролиферативные изменения  в организме животного.

Наиболее распространенный путь передачи ВЛК – горизонтальный: персистентно инфицированные кошки выделяют вирус со слюной, мочой и фекалиями; возможно также  трансплацентарное  инфицирование плода. Вирус примерно одинаково часто выявляется как  у мужских, так  и женских особей. Не отмечено различий в заболеваемости  кошек различных пород.

Распространенность данного заболевания в популяции домашних кошек варьирует от 1 до 33% (1). Персистенция ВЛК вызывает лейкемию, фибросаркому и подавление иммунной системы животных, что приводит к развитию оппортунистических инфекций (2). Вследствие этого до 80% персистентно инфицированных кошек умирает в течение 3 лет после заражения.

Контроль за распространением ВЛК осуществляется путем выявления и изоляции инфицированных кошек, а также  с помощью профилактической вакцинации (3). За рубежом для специфической профилактики вирусной лейкемии кошек используют  несколько видов коммерческих вакцин; наиболее эффективными являются  культуральная инактивированная и рекомбинантная субъединичная (4-13).

Коммерческая рекомбинантная субъединичная вакцина (11) содержит гликопротеин (gp70) оболочки ВЛК подгруппы А, а также первые 34 аминокислоты трансмембранного белка р15Е, который способствует повышению стабильности и иммуногенности белка gp70 (13).

Успешное применение рекомбинантной субъединичной вакцины  против вирусной лейкемии кошек за рубежом, а также отсутствие аналогичных отечественных препаратов, стало основанием для разработки нами рекомбинантной субъединичной вакцины против вирусной лейкемии кошек.

 

Материалы и методы

Культуры клеток и вирусы. В качестве источников гена оболочечного гликопротеина gp70 и первых 34 аминокислот трансмембранного белка р15Е ВЛК использовали суспензионную перевиваемую культуру клеток лимфомы кошки F422 (рис.1), хронически инфицированную ВЛК подгруппы А (14). Клетки выращивали в пластиковых флаконах при использовании среды RPMI 1640, содержащей 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина.

 

 

Рис.1 Культура клеток F422

 

Выделение РНК. Тотальную РНК выделяли из суспензии клеток с использованием набора для выделения РНК «Tri-reagent» («Sigma», США) по методике производителя.

Амплификация и клонирование гена gp70  в E.сoli.

Ген оболочечного гликопротеина  gp70 и первых 34 аминокислот белка р15E (rgp70) был получен при помощи обратной транскрипции (ОТ) и полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Обратная транскрипция проводилась с использованием набора «RevertAid™ First Strand cDNA» (Fermentas) по методике производителя. Полученная кДНК служила матрицей для ПЦР.

ПЦР проводилась с использованием набора  «High Fidelity PCR Enzyme Mix» (Fermentas) с применением следующих праймеров:

1) AAT AAG GAT CCG GCC AAT CCT AGT CCA CAC CAA ATA

2) ATT ATC TCG AGG GCT GTT TCA AGG AGG GCT TTA

Праймеры содержали сайты рестрикции: BamH I (праймер №1) и Xho I (праймер №2).

Использовали следующие параметры ПЦР: 95⁰С – 40 с, 59⁰С – 25 с, 72⁰С – 50 с (для последнего цикла – 15 мин); 28 циклов.

ПЦР-продукт, кодирующий ген оболочечного гликопротеина gp70 и первые 34 аминокислоты трансмембранного белка р15Е, был очищен методом выделения из агарозного геля с помощью набора «DNA Extraction Kit» (Fermentas). Очищенный ПЦР-продукт клонировали в экспрессионный вектор pET23^b (Novagen) по стандартной методике.

Полученная плазмида pET23^b+gp70+р15Е была просеквенирована на участке вставки, для чего были использованы праймеры №1,№2, а также два дополнительных праймера, имеющих места посадки внутри гена gp70:

3) CAC CCA GAA GGG AAG ACA AG

4) GGT CGA GAA ACC AGG CAG AG

Секвенирование проводили с помощью набора «ABI Prism BigDye Terminator v.3.1 Cycle» Sequencing Kit» с использованием  автоматического секвенатора «Applied Biosystems 3130-GА» и компьютерной программы SeqMan. Результаты секвенирования не выявили нарушений в открытой рамке считывания, кодирующей целевой ген, и в последовательности нуклеотидов, кодирующих участок из шести гистидиновый аминокислот, необходимый для очистки белка rgp70 металло-хелатной аффинной хроматографией.

Для экспрессии гена целевого продукта (rgp70) использовали клетки  E.сoli  штамм (BL21(DE3)рLysS.

Очищенный белок rgp70 использовали в качестве экспериментальной

рекомбинантной субъединичной вакцины.

Животные Антигенную активность экспериментальной рекомбинантной субъединичной вакцины проверяли на клинически здоровых беспородных котятах 8-20-недельного возраста. Испытуемый препарат вводили внутримышечно двукратно с интервалом в  21 день. Одна доза вакцины содержала 100 мкг белка rgp70.

Определение виремии.

У всех опытных и контрольных животных до вакцинации, на 21-е и 42-е  сутки после вакцинации отбирали пробы крови для анализа. Сыворотку крови исследовали на наличие матриксного белка р27 ВЛК в твердофазном иммуноферментном анализе (ИФА) с помощью коммерческого набора  «Feline leukaemia virus-p27 antigen ELISA» (Biologicals Ltd., Нидерланды). Постановку ИФА, учет и интерпретацию результатов реакции проводили согласно инструкции.

Сыворотки

 В качестве референтных использовали положительные и отрицательные сыворотки крови кошек и кроликов, полученные из Европейской ветеринарной лаборатории (Нидерланды), а также моноклональные антитела (мкАТ 3-17), любезно предоставленные д-ром Хервиненном (Европейская Ветеринарная лаборатория, Нидерланды). Для анализа использовали сыворотки кошек, полученные после иммунизации их целевым продуктом – белком rgp70.

Очистка рекомбинантного белка rgp70 методом металло-хелатной аффинной  хроматографии (МХАХ).

Клетки E.coli (штамм (BL21(DE3)рLysS), содержащие рекомбинантный антиген лизировали в охлажденном буфере, содержащем 20 мМ трис-HCl + 300 мМ NaCl + 6 М гуанидингидрохлорида + 10 мМ имидазола + 1 мМ PMSF (pH 8,0) из расчета 20 мл на 1 г сырой биомассы. Для деградации ДНК добавляли ДНК-азу в конечной концентрации 5 мкг/мл раствора. Через 30 мин лизат  осветляли центрифугированием при 10 000 об/мин в течение часа. Надосадочную жидкость смешивали с суспензией Ni-NTA агарозы и инкубировали при перемешивании в течение ночи при 4⁰С. Суспензию переносили в стеклянную колонку и промывали 10 объемами буфера, содержащего 20 мМ трис-HCl + 300 мМ NaCl + 50 мМ имидазола+ 6 М мочевины + 1 мМ PMSF (pH 8,0). Целевой продукт элюировали тем же буфером с 250 мМ имидазола.

Концентрацию белка в полученном препарате определяли с помощью набора «Micro BSA Protein Assay Kit» («Pierce», США).

Идентификацию и степень чистоты целевого продукта проверяли методом электрофореза в 12% полиакриламидном геле (ПААГ) с использованием додецилсульфата натрия (ДСН), его активность и специфичность – методами сэндвич-варианта ИФА и иммуноблоттинга с использованием мкАТ 3-17, а также референтных положительных и отрицательных сывороток крови кроликов.

Экспериментальная рекомбинантная субъединичная вакцина

В качестве антигена для иммунизации использовали очищенный методом МХАХ белок rgp70, который смешивали с 6% гидроксидом алюминия (ГОА). Смесь инкубировали 18 ч при 4⁰С, после чего центрифугировали 2 мин. при 2000 об/мин, и осадок дважды отмывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ) для удаления мочевины.

Непрямой иммуноферментный анализ (ИФА). Для оценки иммунологической активности белка rgp70 в лунки иммунологического планшета («Greiner», Германия) вносили по 0,1 мл мкАТ 3-17, разведенных в 0,1 М карбонатно-бикарбонатном буфере (рН 9,5, КББ). Планшет инкубировали 18 ч при 4⁰С. Свободные участки пластика блокировали 1% раствором «Top Block» («Yuro», Швейцария) в ФСБ (1ч при 37⁰С).  После 5-ти кратной промывки планшета  ФСБТ (0,01 М фосфатный буфер, 150 мМ NaCl, 0,1 % твин-20, рН 7,4) в лунки вносили 0,1 мл очищенного белка rgp70 в рабочем разведении. (Оптимальную концентрацию антигена - 1 мкг/мл, и разведение мкАТ - 1:1000, подбирали в предварительных экспериментах методом «шахматного» титрования). Планшет инкубировали 1 час при 37⁰С, отмывали от избытка реагентов и  вносили по 0,1 мл сывороток крови кошек (разведение 1:150) в ФСБТ с добавлением 0,5 % бычьего сывороточного альбумина. Планшет инкубировали 1 час при 37⁰С, отмывали и  добавляли 0,1 мл меченых пероксидазой хрена антител к иммуноглобулину G кошек («Sigma», США). Планшет инкубировали 1 час при 37⁰С, отмывали от избытка реагентов и добавляли   субстратный раствор:  3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМБ, «МДЛ», Россия). Реакцию останавливали 1 М H₂SO₄. Интенсивность окраски в лунках определяли на спектрофотометре с вертикальным лучом «Multiscan MCC»  («Flow», Англия) при длине волны 450 нм (А₄₅₀).

Результаты исследований

Очистка белка  rgp70

Анализ выделенного  в денатурирующих условиях белка rgp70  методом ДСН-электрофореза в 12-типроцентном ПААГ (рис.2) показал, что молекулярная  масса целевого продукта, который практически гомогенен,  приблизительно составляет 50 кДа.  Специфичность очищенного белка rgp70  подтверждена иммуноблоттингом с референтной положительной на ВЛК кроличьей сывороткой (рис.2В), а также в сэндвич-варианте  ИФА с этой же сывороткой (рис.3).  Выход очищенного белка rgp70,  в среднем,  составил  0,04% от веса сырой клеточной массы.

                                              А                                 В

 

Рис. 2 ДСН-электрофорез в 12-типроцентном ПААГ (А) и иммуноблоттинг (В) белка rgp70 со специфической против ВЛК сывороткой крови кролика: 1-лизат клеток E.coli; 2 -  очищенный белок rgp70; 3 – метчик молекулярной массы белков

Рис. 3 Взаимодействие белка  rgp70 с референтными положительной и отрицательной против ВЛК сыворотками крови кролика

 

Применение очищенного белка rgp70 для иммунизации  кошек

На рис. 4 представлены результаты исследования сывороток  крови кошек, иммунизированных экспериментальной серией рекомбинантной субъединичной вакцины на основе очищенного белка rgp70,   методом сэндвич-ИФА  на 0, 21 и 42 день эксперимента. Как следует из представленных данных, все вакцинированные животные имели выраженную сероконверсию к рекомбинантному антигену, у животных контрольной группы сероконверсии не наблюдалось.

 

Рис. 4 Усредненный уровень иммунного ответа (результаты ИФА) после вакцинации кошек белком rgp70: «опыт» - 4 вакцинированные кошки; «контроль» - 3 невакцинированные кошки.

Определение виремии

Известно, что выявление в крови кошек матриксного белка р27 ВЛК свидетельствует о наличии виремии у животных (3). При оценке антигенной активности испытуемой вакцины нами не был выявлен антиген р27 ВЛК  в сыворотке крови всех опытных и контрольных котят в  течение всего периода наблюдения.

Безопасность вакцины

В месте введения препарата реакции гиперчувствительности, а также болезненной реакции при пальпации не наблюдалось. У одной кошки введение препарата индуцировало образование умеренной припухлости (размером не более 0,4 см) в месте инъекции; данная реакция не была сопряжена с развитием эритемы и повышением температуры. Подкожная припухлость исчезала на седьмой день после каждой иммунизации.

Обсуждение

Распространенность вирусной лейкемии  в популяции домашних кошек по всему миру варьирует от 1 до 33% (1), а по данным исследований 2500 кошек Центрально-Черноземного региона РФ, инфицированность животных вирусом лейкемии достигает там 12,6 % (15). В связи с этим, актуальной проблемой является контроль за распространением  и профилактика этого заболевания.

Вакцинация является главным методом специфической профилактики инфекционных заболеваний животных. Как показали наши исследования, применение рекомбинантной субъединичной вакцины на основе негликозилированного рекомбинантного белка gp70, синтезированного в клетках Е.coli,  - белка rgp70 ВЛК подгруппы А, приводит к образованию специфических гуморальных антител  у иммунизированных этим белком  кошек. Это коррелирует с результатами, полученными ранее за рубежом  (13): кошки, иммунизированные рекомбинантной субъеденичной вакциной на основе негликозилированного белка rgp70, были устойчивы к контрольному заражению вирулентным штаммом вируса. Таким образом, отсутствие олигосахаридных остатков в молекуле белка rgp70 (приводящее к снижению его молекулярной массы до 50 kDa), не препятствует образованию у животных вируснейтрализующих антител.

Разработанная нами вакцина на основе белка rgp70 не вызывала побочных явлений: статистически достоверных отклонений в температуре тела, а также поведенческих реакциях кошек  относительно контрольной группы не наблюдалось. Это свидетельствует о том, что разработанная нами экспериментальная рекомбинантная субъединичная вакцина против вирусной лейкемии кошек в испытуемой дозе является безвредной и ареактогенной.

 

 

Список использованной литературы

1. Levy J., et al. //Journal of Feline Medicine and surgery. 2008. 10. 300.
2. Hardy W.D. //Feline leukemia virus. 1980. 33.
3. Hartmann C. //Infectious diseases of the dog and cat. 2006. 105.
4. Sparkes A.H. //J Feline Med Surg. 2003. 5. 97.
5. Sparkes A.H. //J. Small. Anim. Pract. 1997. 38. 187.
6. Jarrett O., Ganiere J.P. //Vet. Rec. 1996. 138. 7.
7. Hines D.L., et al. //J. Am. Vet. Med. Assoc. 1991. 199. 1428.
8. Hoover E.A., et al. //J. Am. Vet. Med. Assoc. 1991. 199. 1392.
9. York S.M.,York C.J. //J. Am. Vet. Med. Assoc. 1991. 199. 1419.
10. Tizard I., Bass E.P. //J. Am. Vet. Med. Assoc. 1991. 199. 1410.
11. Marciani D.J., et al. //Vaccine. 1991. 9. 89.
12. Poulet H., et al. //Vet. Rec. 2003. 153. 141.
13. Clark N., et al. // J. Am. Vet. Med. Assoc. 1991. 199. 1433.
14. Rickard C.G., et al. //J. Natl. Cancer Inst. 1969. 42. 987.
15. Федосов Д.В. // Сб. науч. тр. «Молекулярная диагностика 2007». 2007. 111.